ناقل‌هاي ژن کلونينگ براي يوکاريوت‌ها(1)
ناقل‌هاي ژن کلونينگ براي يوکاريوت‌ها
قسمت اول: پلاسميد 2 ميکرومتري
در قسمت‌هاي قبل 3 نوع از حاملين يا ناقل‌هاي ژني مورد استفاده در باکتري اشرشياکولي که شامل پلاسميد باکترياي، فاژ لاندا و فاژ M13 بود را معرفي کرديم.
در بيشتر مطالعات ژنتيکي و زيست مولکولي مثل مطالعه‌ي ساختار و فعاليت ژن‌ها از اي.کولاي که يک پروکاريوتي است به عنوان ميزبان استفاده مي‌شود به طوري که حامل‌هاي ژني متنوعي براي آن طراحي و ساخت شده است.
اما براي برخي از اهداف بيوتکنولوژي، نظير خلق GMOها، استفاده از يک ميزبان يوکاريوت ضرورت مي‌يابد. با توجه به تفاوت‌هاي دستگاه‌‌هاي بيان ژن و ويرايش RNA که در سلولهاي پروکاريوتي ( شامل تمام باکتري‌ها) و يوکاريوتي(شامل سلولهاي گياهي، جانوري و انواع آغازيان) وجود دارد بنابراين لازم است حامل‌هاي ژني ديگري را به کار برد.
مخمر ساکرومايسس سروزيه، که مخمر مورد استفاده در تخمير و نانوايي است، يکي از مهمترين موجودات در بيوتکنولوژي مي‌باشد.
ساکاورومايسس سروزيه گونه‌اي مخمر جوانه‌اي است که داراي تکثير غير جنسي، به طريق جوانه زدن است. اين مخمر از گذشته‌ي دور مفيدترين مخمر براي بشر بوده است چرا که در تخمير خمير نان و الکل سازي نقش اساسي دارد.
امروزه اين تک ياخته‌ي يوکاريوتي علاوه بر کاربرد سنتي خود به عنوان يک ميزبان يوکاريوتي براي توليد محصولات دارويي نوترکيب و پروتئين‌هاي يوکاريوتي از ژن‌هاي کلون شده اهميت ويژه‌اي يافته است. لذا تلاش‌ها زيادي براي ساخت حاملين ژني براي اين مخمر صورت گرفته است.
با کشف پلاسميدي به نام پلاسميد 2µm در مخمر، که از معدود پلاسميدهاي يافت شده در سلولهاي يوکاريوت است، پيشرفت در ساخت انواع ناقلين کلونينگ براي مخمر، تسريع شد.
پلاسميد 2µm که در اکثر سويه‌هاي ساکرومايسس سروزيه يافت مي‌شود و 70 تا 200 نسخه از آن در سلول مخمر موجود مي‌باشد در واقع خود اساس و منشا ساخت انواع ناقل‌هاي کلونينگ يوکاريوتي است.
پلاسميد 2µm به اندازه‌ي 6 کيلوباز مي‌باشد که اين اندازه براي يک حامل ژني بسيار مطلوب مي‌باشد. همانندسازي پلاسميد 2µm، برخلاف همانندسازي پلاسميدهاي باکتريايي، کاملاً تحت کنترل سيکل تقسيم سلولي است و دستگاه پروئيني که اين پلاسميد و کرومزوم‌هاي مخمر را همانندسازي مي‌کند يکسان است و پروتئين‌هاي آن توسط ژن‌هاي هسته‌اي کد مي‌شوند.
پلاسميد 2µm به طور کامل تعيين توالي و ژن‌هاي آن مشخص شده است. اين پلاسميد داراي يک جايگاه شروع همانندسازي، و 4 ژن به نام‌ها REP1, REP2, FLP1 و D است. پروتئين حاصل از REP1, REP2 در تکثير پلاسميد دخالت دارند و پروتئين کد شده توسط ژن FLP1 با ايجاد نوترکيبي درون مولکولي ترتيب ژني را بازآرايي مي‌کند.
با وجودي که اندازه‌ي کوچک اين پلاسميد و همچنين فراوانيش در سلولهاي مخمر، آن را گزينه‌ي مناسبي براي کاربرد‌هاي مهندسي ژنتيک کرده است اما استفاده از آن چندان هم بي دردسر نيست. از جمله مشکلات پيش رو در کلونينگ ژن به وسيله‌ي پلاسميد 2µm حل مسئله‌ي نشانگر انتخابي است. چراکه وجود نشانگر انتخابي براي جداسازي ياخته‌هاي تراريخت از آنهايي که DNA نوترکيب را دريافت نکرده اند ضروري مي‌باشد.
معمولاً براي حل مشکل گزينش تراريخت‌ها از ميزبان‌هايي که در اثر جهش ژنتيکي توان ساخت يکي از آنزيم‌هاي دخيل در مسير متابوليسمي اسيدآمينه‌اي را از دست داده اند استفاده مي‌کنند. اين ميزبان را در اصطلاح «جهش يافته‌ي اگزوتروف» مي‌گويند چرا که براي ادامه‌ي حياتش لازم است که اسيدآمينه‌هايي که در مسير متابوليسمي آنها نقص ايجاد شده است به محيط کِشتش اضافه شود.
با وارد کردن ژن سالم آنزيمي که در ميزبان جهش يافته است به ناقل ژن مي‌توان تراريخت‌ها را غربال کرد. به اين ترتيب که با کشت سلول‌ها در «محيط کشت حداقل» (محيط فاقد هرگونه اسيدآمينه) تنها تراريخت‌ها، که از طريق DNA نوترکيب ژن سالم را دريافت کرده اند، قادر به ادامه‌ي حيات هستند و غير تراريخت‌ها نابود مي‌شوند.
نويسنده: سمانه سادات عنايتي
تنظيم براي تبيان: محسن مرادي