ژن کلونینگ
ژن کلونينگ
ژن کلونينگ فرآيندي است که طي آن توالي مشخصي از DNA را جداسازي مي‌کنند تا نسخه‌هاي يکساني از آن را در محيط طبيعي ( سلول يا بافت زنده ) بدست آورند.
هدف از ژن کلونينگ فراهم کردن نسخه‌هاي متعدد از يک ژن منفرد است. تکثير يک ژن در حوزه‌هاي مختلف تحقيقاتي مورد استفاده است. به علاوه داراي کاربردهاي پزشکي از قبيل ژن درماني و کاربردهاي صنعتي نظير توليد مقدار زيادي از يک پروتئين مي‌باشد.
براي کلون کردن ژن قطعه‌اي از DNA را از موجودي به موجود ديگر منتقل مي‌کنند. سلولي را که منشا DNA از آن است را « دهنده » و سلولي را که آن را دريافت مي‌کند « ميزبان» مي‌گويند.
کلونينگ ژن به روش‌هاي مختلفي صورت مي‌گيرد اما اساس همه‌ي آنها به اين صورت است که DNA هدف از سلول دهنده استخراج مي‌شود و با کمک آنزيم‌هايي برش داده مي‌شود و به داخل يک مولکول DNA حلقوي، که معمولاً يک پلاسميد است و نقش ناقل ( وکتور ) را دارد، وارد مي‌شود. به اين ترتيب يک مولکول DNA نوترکيب ساخته مي‌شود. در مرحله‌ي بعد DNA نوترکيب را به سلول ميزبان که اغلب نوعي باکتري مي‌باشد منتقل مي‌کنند. اين مرحله را ترنسفورماسيون مي‌نامند. DNA نوترکيب در سلول ميزبان همانندسازي مي‌کند و همراه سلول ميزبان تکثير مي‌شود. سلول‌هاي حاصل از تقسيم سلول ميزبان اوليه، نسخه‌هايي از DNA نوترکيب همانندسازي شده را به ارث مي‌برند. سلول‌هاي باکتري به دنبال تقسيمات متعدد کلني تشکيل مي‌دهند و از آنجا که اعضاي اين کلوني حاوي يک يا چند نسخه از ژن مورد نظر ما که در DNA نوترکيب حمل مي‌شود مي‌باشد، مي‌توان گفت اين ژن کلون شده است.
استخراج و برش ـ اولين گام در توليد DNA نوترکيب و سپس کلون کردن آن، استخراج و برش وکتور از سلول باکتري و DNA از سلول دهنده مي‌باشد.
براي استخراج DNA از سلول دهنده، ابتدا بايد «عصاره‌ي سلولي» تهيه کرد. براي اين منظور غشاي سلول را متلاشي مي‌کنند تا محتويات آن خارج شود سپس مخلوط حاصل را سانتريفيوژ مي‌کنند تا زوائد آن ته‌نشين شود و مايع رويي که «عصاره‌ي سلولي» است و حاوي DNA مي‌باشد را جمع آوري مي‌کنند. عصاره‌ي سلولي علاوه بر DNA حاوي پروتئين و RNA نيز مي‌باشد. با يکي از روش‌هاي «تجزيه‌ي آنزيمي پروتئين و RNA » يا «کروماتوگرافي تعويض يوني» DNA را از عصاره‌ي سلولي تخليص مي‌کنند.
براي استخراج پلاسميد از سلول باکتري، بعد از تخليص DNA بايد پلاسميد را از DNA کرومزوم باکتري جدا کرد. براي اين منظور از تکنيک « اولتراسانتريفيوژ » که بر مبناي شيب جرمي مي‌باشد استفاده مي‌کنند.
بعد از جداسازي، DNA سلول دهنده بايد به قطعات کوچکتر بريده شود. برش DNA به قطعات کوچکتر را مي‌توان از طرق راه‌هاي مختلفي انجام داد از آن جمله ايجاد شکست در DNA با استفادها از امواج صوتي ( سونيکيت )مي‌باشد. در اين صورت طول قطعات حاصل از يک مولکول DNA با مولکول ديگر متفاوت خواهد بود چرا که شکست مولکول DNA به صورت تصادفي صورت مي‌گيرد. کشف «آنزيم‌هاي محدود کننده» (restriction enzymes) محققان را قادر ساخت تابتوانند قطعات با طول يکسان را از چندين مولکول DNA يکسان فراهم کنند. آنزيم‌هاي محدود کننده باکتري‌ها را قادر به دفاع در مقابل فاژها مي‌کند. اين آنزيم‌ها مولکول DNA را درمحل‌هاي ويژه‌اي باترتيب نوکلوتيدي خاصي قطع مي‌کنند. بنابراين براي آنکه يک مولکول DNA با اين آنزيم‌ها بريده شود، وجود توالي‌هاي خاصي به نام «جايگاه محدود کننده» در مولکول DNA ضروري است و بايد براي برش DNA به دنبال آنزيمي گشت که داراي بيش از 2 جايگاه محدود کننده بر روي آن باشد.
همچنين مزيت ديگر استفاده از آنزيم‌هاي محدود کننده اين است که مي‌توان از همان آنزيم براي برش پلاسميد ناقل استفاده کرد و به اين طرق امکان انطباق دو انتهاي قطعه‌ي ژن هدف با دو انتهاي بريده شده‌ي پلاسميد را به سادگي فراهم کرد.
نويسنده: سمانه سادات عنايتي
ادامه دارد...