ناقل‌های ژن کلونینگ برای یوکاریوت‌ها
قسمت اول: پلاسمید 2 میکرومتری
در قسمت‌های قبل 3 نوع از حاملین یا ناقل‌های ژنی مورد استفاده در باکتری اشرشیاکولی که شامل پلاسمید باکتریای، فاژ لاندا و فاژ M13 بود را معرفی کردیم.
در بیشتر مطالعات ژنتیکی و زیست مولکولی مثل مطالعه‌ی ساختار و فعالیت ژن‌ها از ای.کولای که یک پروکاریوتی است به عنوان میزبان استفاده می‌شود به طوری که حامل‌های ژنی متنوعی برای آن طراحی و ساخت شده است.
اما برای برخی از اهداف بیوتکنولوژی، نظیر خلق GMOها، استفاده از یک میزبان یوکاریوت ضرورت می‌یابد. با توجه به تفاوت‌های دستگاه‌‌های بیان ژن و ویرایش RNA که در سلولهای پروکاریوتی ( شامل تمام باکتری‌ها) و یوکاریوتی(شامل سلولهای گیاهی، جانوری و انواع آغازیان) وجود دارد بنابراین لازم است حامل‌های ژنی دیگری را به کار برد.
مخمر ساکرومایسس سروزیه، که مخمر مورد استفاده در تخمیر و نانوایی است، یکی از مهمترین موجودات در بیوتکنولوژی می‌باشد.
ساکاورومایسس سروزیه گونه‌ای مخمر جوانه‌ای است که دارای تکثیر غیر جنسی، به طریق جوانه زدن است. این مخمر از گذشته‌ی دور مفیدترین مخمر برای بشر بوده است چرا که در تخمیر خمیر نان و الکل سازی نقش اساسی دارد.
امروزه این تک یاخته‌ی یوکاریوتی علاوه بر کاربرد سنتی خود به عنوان یک میزبان یوکاریوتی برای تولید محصولات دارویی نوترکیب و پروتئین‌های یوکاریوتی از ژن‌های کلون شده اهمیت ویژه‌ای یافته است. لذا تلاش‌ها زیادی برای ساخت حاملین ژنی برای این مخمر صورت گرفته است.
با کشف پلاسمیدی به نام پلاسمید 2µm در مخمر، که از معدود پلاسمیدهای یافت شده در سلولهای یوکاریوت است، پیشرفت در ساخت انواع ناقلین کلونینگ برای مخمر، تسریع شد.
پلاسمید 2µm که در اکثر سویه‌های ساکرومایسس سروزیه یافت می‌شود و 70 تا 200 نسخه از آن در سلول مخمر موجود می‌باشد در واقع خود اساس و منشا ساخت انواع ناقل‌های کلونینگ یوکاریوتی است.
پلاسمید 2µm به اندازه‌ی 6 کیلوباز می‌باشد که این اندازه برای یک حامل ژنی بسیار مطلوب می‌باشد. همانندسازی پلاسمید 2µm، برخلاف همانندسازی پلاسمیدهای باکتریایی، کاملاً تحت کنترل سیکل تقسیم سلولی است و دستگاه پروئینی که این پلاسمید و کرومزوم‌های مخمر را همانندسازی می‌کند یکسان است و پروتئین‌های آن توسط ژن‌های هسته‌ای کد می‌شوند.
پلاسمید 2µm به طور کامل تعیین توالی و ژن‌های آن مشخص شده است. این پلاسمید دارای یک جایگاه شروع همانندسازی، و 4 ژن به نام‌ها REP1, REP2, FLP1 و D است. پروتئین حاصل از REP1, REP2 در تکثیر پلاسمید دخالت دارند و پروتئین کد شده توسط ژن FLP1 با ایجاد نوترکیبی درون مولکولی ترتیب ژنی را بازآرایی می‌کند.
با وجودی که اندازه‌ی کوچک این پلاسمید و همچنین فراوانیش در سلولهای مخمر، آن را گزینه‌ی مناسبی برای کاربرد‌های مهندسی ژنتیک کرده است اما استفاده از آن چندان هم بی دردسر نیست. از جمله مشکلات پیش رو در کلونینگ ژن به وسیله‌ی پلاسمید 2µm حل مسئله‌ی نشانگر انتخابی است. چراکه وجود نشانگر انتخابی برای جداسازی یاخته‌های تراریخت از آنهایی که DNA نوترکیب را دریافت نکرده اند ضروری می‌باشد.
معمولاً برای حل مشکل گزینش تراریخت‌ها از میزبان‌هایی که در اثر جهش ژنتیکی توان ساخت یکی از آنزیم‌های دخیل در مسیر متابولیسمی اسیدآمینه‌ای را از دست داده اند استفاده می‌کنند. این میزبان را در اصطلاح «جهش یافته‌ی اگزوتروف» می‌گویند چرا که برای ادامه‌ی حیاتش لازم است که اسیدآمینه‌هایی که در مسیر متابولیسمی آنها نقص ایجاد شده است به محیط کِشتش اضافه شود.
با وارد کردن ژن سالم آنزیمی که در میزبان جهش یافته است به ناقل ژن می‌توان تراریخت‌ها را غربال کرد. به این ترتیب که با کشت سلول‌ها در «محیط کشت حداقل» (محیط فاقد هرگونه اسیدآمینه) تنها تراریخت‌ها، که از طریق DNA نوترکیب ژن سالم را دریافت کرده اند، قادر به ادامه‌ی حیات هستند و غیر تراریخت‌ها نابود می‌شوند.
نویسنده: سمانه سادات عنایتی
تنظیم برای تبیان: محسن مرادی
