بیولومینسانس(4)
مزایای کاربرد بیولومینسانس
همان طور که در قسمت سوم این مجموعه بیان شد از بیولومینسانس در سنجش‌های زیستی ، که با ابعاد و اهداف وسیعی صورت می‌گیرد، می‌توان استفاده کرد و به دلیل برتری‌هایی که نسبت به روش‌های دیگر سنجش دارد، تکنیک‌های بیولومینسانس روزبه روز گسترده‌تر و پرکاربردتر می‌شود. در این مقاله به بررسی برخی جنبه‌های سنجش‌های مبتنی بر بیولومینسانس و مقایسه‌ی آن با روش‌های دیگر سنجش، می‌پردازیم.
1. مطالعات فیزیولوژیکی بر روی سیستم‌های زنده
در مطالعات فیزیولوژیکی معمولاً برای بررسی یک فرایند حیاتی از ردیاب‌های وارد شونده به سلول استفاده می‌شود. این نوع ردیاب‌ها که عمدتاً نوعی مولکول فلوروفور یا رادیوایزوتوپ است از طریق واردشدن یا اختلاط یافتن با یک واکنش سلولی ویژه عمل می‌کنند. از این رو حضور آنها می‌تواند بر فرایند مورد بررسی تاثیر گذارد و به طور بالقوه منجر به بروز رفتارهای تقلیل یافته یا مصنوعی شوند. بنابراین نتایج حاصل چندان قابل اعتماد نمی‌باشند.
ردیاب مورد استفاده در سنجش‌های فیزیولوژیکی باید کمترین اثر را بر فرایند مورد بررسی داشته باشد تا سبب ایجاد استرس فیزیولوژیک در جاندار مورد مطالعه نشود.
یکی از بهترین راه‌ها برای به حداقل رساندن اثرات ردیاب‌های وارد شونده به سلول و کاهش احتمال ایجاد استرس فیزیولوژیک ناشی از ورود یک ماده‌ی خارجی به سلول، استفاده از آنها در غلظت‌های پایین می‌باشد.
ردیاب‌های فلوروفور به این ترتیب عمل می‌کنند که با دریافت فتون معرفی شده به آنها تحریک شده و با نشر فتونی با انرژی کمتر، دوباره به حالت اولیه‌ی خود بازمی‌گردد. زمانی که ابزار سنجش زیستی مولکول فلوروفور باشد، از اندازه‌گیری شدت فتون‌های نشری توسط دستگاه‌های اسپکتروفتومتری برای گزارش بررسی استفاده می‌شود.
در استفاده از فلوروفور‌ها، «نور پس زمینه» می‌تواند سبب بروز خطا در نتیجه‌ی اعلام شده توسط دستگاه اسپکتروفتومتر گردد. «نور پس زمینه» را دو عامل ایجاد می‌کند:
• فتون‌های تحریک کننده اولیه
• فلوروفورهای ضعیفی که به طور طبیعی در سیستم‌های زیستی وجود دارند
آشکار کنندهی نوری دستگاه باید متحمل تشخیص نور نشری از فتون‌های تحریک کننده و نور تداخلی حاصل از فلوروفورهای زیستی، گردد.
همانطور که در بالا گفته شد برای کاهش تاثیرات ردیاب در فرایند زیستی مورد بررسی توصیه می‌شود که غلظت را کم کنند. اما در مورد سنجش‌های فلوروژنیک کاهش غلظت ردیاب که در اینجا یک فلوروفور است سبب غالب شدن نور پس زمینه به نور نشری می‌شود و متعاقباً میزان خطای نتیجه افزایش می‌یابد.
اینجاست که تکنیک‌های بیولومینساسی با حساسیت بالایشان به کمک می‌آیند. از آنجاکه در اینجا عامل تحریک کننده برای نشر نور، یک برهمکنش شیمیایی است نه یک فتون و همچنین طول موج نشری مشخص و قابل اندازه‌گیری بدون نیاز به استفاده از فیلتر‌های تک فام کننده است، مشکل نور پس زمینه دیگر وجود نخواهد داشت. ضمن اینکه عامل منتشر کنندهی که پروتئین لوسیفرین است در فرایند فیزیولوژیک مورد بررسی دخالت نمی‌کند و وارد آن نمی‌شود. به علاوه ناشر نور یک مولکول زیستی است و سبب برهم خوردن تعادل سیستم حیاتی سلول نمی‌شود.
2. تعیین ویژگی‌های سلول‌های زنده در کشت‌های سلولی
تعیین ویژگی‌های سلول‌های زنده در کشت یک مشکل بسیار اساسی است. هنگامی که اثر مواد تنظیم کنندهی رشد و همچنین عوامل سمی مورد مطالعه است اهمیت تکنیک مورد استفاده بیشتر می‌شود. اندازه‌گیری تعداد سلول‌های زنده در کشت از جنبه‌های اساسی سنجش زیستی در شرایط آزمایش است.
نوکلئوتید آدنوزین تری فسفات (ATP) نقش مهمی در مبادله‌ی انرژی در سیستم‌های بیولوژیک ایفا می‌کند. ATP به عنوان دهنده‌ی اصلی انرژی در همه‌ی فعالیت‌های متابولیکی سلول حضور دارد. بیشتر ATPای که در سلول زنده یافت می‌شود فرایند‌های کاتابولیسمی ( تجزیه کننده و انرژی زا ) و آنابولیسمی ( سازنده و انرژی خواه ) را به هم پیوند می‌دهند.
نظر به اینکه همه‌ی سلول‌ها به ATP نیاز دارند تا زنده بمانند و عملکردهای ویژه‌یشان را انجام دهند بنابراین اندازه‌گیری ATP اساس مطالعه‌ی فرایند‌های حیاتی است. از این رو ATP به عنوان ابزاری برای بررسی عملکرد سلول‌های زنده استفاده می‌شود.
روش‌های زیادی برای تعیین ATP استفاده می‌شود که موفق‌ترین آنها تکنیک‌های بیولومینسانس است چراکه حساسیت بالا و دامنه‌ی پویایی گسترده‌ای دارند. «تکنیک بیولومینسانس ATP» برای تعیین سطوح ATP در تعدادی از انواع متفاوت سلولی استفاده می‌شود.
واکنش شیمیو لومینسانس که توسط آنزیم لوسیفراز حاصل از حشره‌ی شب تاب ( Photinus pyralis ) کاتالیز می‌شود به صورت زیر است:
منیزیم و ATP ، پروتئین لوسیفرین را به شکلی تبدیل می‌کنند که قابل اکسید شدن کاتالیتیکی توسط آنزیم می‌باشد و از اکسید شدن لوسیفرین پرتویی با طول موج 562nm ساتع می‌شود.
تحت شرایط بهینه، شدت نوری که منتشر می‌شود با غلظت ATP رابطه‌ی خطی دارد. برای اندازه‌گیری ATP، سلول را با کمک مواد تخریب کنندهی غشا، از قبیل دترژنت‌ها، لیز می‌کنند. این عمل باعث رها شده ATP به محیط کشت می‌شود. با افزودن لوسیفرین و لوسیفراز، در حضور ATP نور 560nm منتشر می‌شود که با اندازه‌گیری شدت نور توسط اسپکتروفتومتر غلظت ATP را تعیین می‌کنند. به سبب حساسیت بالای آنزیم لوسیفراز، در این روش سنجش زیستی ، ATP با حداقل غلظت 50*10-18 مول قابل اندازه‌گیری است.
در حال حاضر تلاش‌هایی برای استفاده از «تکنیک بیولومینسانس ATP» برای تعیین میزان تکثیر و بررسی مسمویت سلولی حاصل از دو ماده‌ی متفاوت، در موجود زنده، برای جلوگیری از استفاده‌ی رادیوایزوتوپ‌ها صورت می‌گیرد.
رادیوایزوتوپ‌ها در پزشکی هسته‌ای برای درمان و تشخیص انواع سرطان و مراحل آن به کار می‌رود. به این منظور استفاده از رادیوایزوتوپ‌های تابش‌کننده گاما سودمندتر است. اشعه‌ی گامای ساتع شده از این مواد میزان پیشرفت سرطان در بافت‌های بدن را مشخص می‌کند.
با توجه به اثراتی که تشعشعات هسته‌ای می‌تواند بر مولکول‌های زیستی بگذارد از جمله یونیزاسیون، ایجاد انواع رادیکال‌های آزاد و جهش زایی، استفاده‌ی تشخیصی از این پرتوها می‌تواند همراه عوارض متعدد مانند تخریب بافت مغز استخوان و در نتیجه کم خونی همچنین تاثیر بر روی سیستم گوارش، غدد تناسلی، مغز و غیره در فرد مورد آزمایش شود و علائمی نظیر سرگیجه، بی‌اشتهایی، تعریق شدید و اختلال تنفسی را به دنبال داشته باشد. ضمن اینکه این تشعشعات در دراز مدت خود می‌توان عاملی برای ایجاد سرطان باشد.
از این رو استفاده از تکنیک‌های بیولومینسانس برای تشخیص‌های طبی، با توجه به طبیعی و بدون عارضه بودن آنها از یک سو و حساسیت بالای آن از سوی دیگر می‌تواند جایگزین بسیار مناسبی برای روش‌های مبتنی بر رادیوایزوتوپ‌ها باشد.
تهیه کننده: سمانه سادات عنایتی
