کلونینگ ژن-قسمت دوم
گام دوم: ترنسفورماسیون
بعد از تهیه و طراحی ناقل مناسب و اتصال ژن مورد نظر به آن، DNA نوترکیب باید وارد سلول زنده شود تا با استفاده از دستگاه همانندسازی موجود در سلول، ژن هدف تکثیر و بیان شود.
عمل انتقال DNA نوترکیب به سلول زنده «ترنسفورماسیون» است و موجودی که از این طرق DNA نوترکیب را دریافت می‌کند تراریخت یا ترنسژنیک(Transgenic) نام دارد.
سلول‌هایی که معمولاً به عنوان پذیرنده‌ی مولکول نوترکیب مورد استفاده قرار می‌گیرند، باکتری‌ها هستند چراکه رشد و تکثیر در باکتری‌ها به سرعت صورت می‌گیرد و کشت آنها نیز ساده‌تر و ارزان‌تر است.
اکثر گونه‌های باکتریایی توانایی جذب مولکول DNA از محیط اطرافشان را دارند. DNA خارجی در باکتری اغلب تجزیه می‌شود اما در صورت داشتن جایگاه شروع همانندسازی قابل شناسایی توسط سیستم همانندسازی باکتری، می‌تواند در سلول میزبان باقی بماند و تکثیر شود.
قدرت جذب DNA خارجی برای همه‌ی باکتری‌ها به یک میزان نمی‌باشد. به عنوان مثال باکتری اشرشیاکولی، که پرکاربردترین باکتری در مهندسی ژنتیک و بیوتکنولوژی میکروبی است، در شرایط عادی قدرت جذب کمی دارد و میزان وقوع تراریختی در این شرایط مطلوب نخواهد بود. از این رو برای بهینه سازی میزان تراریختی باید باکتری را تحت تیمارهای خاصی قرار داد تا قدرت جذبش افزایش یابد.
در دهه‌ی 1970 با مشاهده‌ی اینکه سلول‌های ای.کولای خیسانده شده در محلول نمکی بسیار سرد، نسبت به سلول‌هایی که با محلول نمکی تیمار نشده اند، DNA را خیلی بهتر جذب می‌کنند، راه حل مشکل موجود در مرحله‌ی ترنسفورماسیون یافت شد. به این ترتیب که باکتری‌ها را در محلول کلرید کلسیم یا کلرید ربیدیوم با غلظت 50 میکرومولار قرار می‌دهند و سپس DNA نوترکیب را به باکتری تیمار شده می‌افزایند.
کلرید کلسیم تنها سبب اتصال DNA به دیواره‌ی باکتری می‌شود و به طور مستقیم در جذب DNA نقش ندارد. برای جذب واقعی DNA به درون سیتوپلاسم باکتری، آن را در معرض شوک حرارتی قرار می‌دهند که سبب افزایش نفوذپذیری دیواره‌ی باکتری می‌شود. حرکت DNA به درون باکتری با بالا بردن دمای انکوباتور تا 42°C تسریع می‌شود.
گام بعدی در کلونینگ ژن، شناسایی تراریخت‌ها است. از آنجا که در مرحله‌ی تولید DNA نوترکیب، تقریباً کنترلی در نحوه‌ی اتصال قطعه‌ی DNA به مولکول ناقل وجود ندارد، در پایان مرحله مخلوطی از انواع اتصال‌ها، از جمله؛ مولکول ناقل فاقد قطعه‌ی DNA ، قطعات DNA هدف متصل نشده به ناقل و مولکول‌های ناقلی که به صورت نامطلوب تولید شده اند، حاصل خواهد شد. همچنین در مرحله‌ی ترنسفرماسیون برخی سلول‌ها DNA نوترکیب را دریافت نمی‌کنند و کلونی حاصل از رشد آنها ژن مورد نظر را دربر ندارد. از این رو لازم است تا کلونی‌هایی که DNA نوترکیب مطلوب را دریافت کرده‌اند به طریقی شناسایی شوند. برای این منظور مهندسان ژنتیک، تکنیک‌های مختلف طراحی وکتورها یا ناقل‌های مورد استفاده در کلونینگ را متناسب با هدفی که در کلونینگ ژن دنبال می‌کنند، مورد استفاده قرار می‌دهند که در بخش دیگری به توضیح آن می‌پردازیم.
کلونینگ DNA کاربردهای متعددی دارد که در مجموع به آنها «مهندسی ژنتیک» گفته می‌شود که از آن جمله تعیین توالی ژنوم موجودات است که راه را برای تعیین توالی پروتئین‌های موجودات و استفاده از آن در مطالعه‌ی عملکرد پروتئین‌ها و مهندسی پروتئین می‌گشاید.
همچنین در تهیه‌ی «اثر انگشت DNA » برای تشخیص هویت، تشخیص بیماری‌های وراثتی، ژن درمانی، تولید پروتئین‌های نوترکیب، ایجاد موجودات تراریخت، تولید انبوه تجاری پروتئین‌های مختلف از جمله انسولین انسانی، هورمون رشد و آنزیم‌های مورد استفاده در صنعت کاربرد دارد.
تبیان
سمانه سادات عنایتی
