مشاهده میكروسكوپی سلول های گیاهی و جانوری، جلسه اول
آشنایی با روش های آماده سازی نمونه های میکروسکوپی
مشاهده سلول های گیاهی
برای مشاهده سلول های گیاهی لازم است از بافت های آنها برش های نازكی تهیه نمود. با توجه به هدف مطالعه نوع برش گیری در بافت های مختلف، متفاوت است (به عنوان نمونه، در مورد اندام های استوانه ای شكل نظیر ریشه و ساقه، برش ها به صورت طولی و یا عرضی تهیه می شود). سپس، بهترین برش ها برای رنگ آمیزی انتخاب شده و مراحل بعدی بر روی آنها صورت می گیرد. رنگ ها كمك می كنند بافت های مختلف از هم قابل تشخیص شده تا یاخته ها و ضمائم آنها از هم متمایز گردند. رنگ آمیزی بافت گیاهی به دو روش ساده و مضاعف انجام می شود. در رنگ آمیزی ساده، هدف مطالعه وضعیت یك نوع بافت است. به همین علت از رنگی استفاده می شود كه به طور اختصاصی آن بافت را رنگ می كند. در رنگ آمیزی مضاعف دو دسته اصلی بافت ها (بافت های چوبی و سلولزی) از هم متمایز شده که بدین منظور از دو رنگ استفاده می شود. یك رنگ سلولز و دیگری چوب، چوب پنبه و یا کوتین را رنگ می کند. بعد از رنگ آمیزی، برش ها برای مطالعه زیر میكروسكوپ آماده‌اند.
مشاهده سلول های بافت جانوری
سلول های جانوری از سلول های گیاهی كوچكترند. به همین علت ضخامت لایه ای كه برای بررسی تهیه می شود كمتر از بافت های گیاهی باشد، به همین دلیل لازم است برش گیری به كمك دستگاه های ویژه‌ای به نام میكروتوم انجام شود. همچنین به علت نرم بودن بافت های جانوری، قبل از برش گیری، لازم است قالب پارافینی بافت تهیه شود. برای این‌كار بافت در ظرف مخصوص قرار داده شده و ظرف از پارافین مذاب پر می گردد. بعد از بستن پارافین از دستگاه میكروتوم برای تهیه برش با ضخامت مشخص استفاده می شود.
آینده های شغلی یك زیست شناس ـ كارشناس سلولی در آزمایشگاه پاتوبیولوژی
كارشناسان سلولی در آزمایشگاه های پاتوبیولوژی با شناختی كه از ویژگی های سلول های با نسبت های مختلف بدن دارند، می توانند در تشخیص بسیاری از بیماری ها نظیر سرطان نظر تعیین كننده و كلیدی را به پزشك متخصص ارائه دهند. افراد متخصص و فعال در این زمینه با زمینه های مختلفی نظیر بافت شناسی، زیست شناسی سلولی، روش های تهیه انواع نمونه های میكروسكوپی، كار با میكروسكوپ های مختلف و اثر هر بیماری در شكل سلول و بافت آشنا باشند. معمولاً فارغ التحصیلان رشته های زیست شناسی سلولی، بافت شناسی و پاتوبیولوژی می توانند در این حرفه موفق شوند.
وسایل مورد نیاز
بافت گیاهی
- شیشه ساعت یا پلیت شیشه‌ای
- تیغ برای مقطع‌گیری
- آب مقطر
- آب ژاول %20
- استیک‌اسید %10
- یونولیت
- متیلن‌بلو یا فوشین آمونیاکی (برای تشخیص بافت‌های چوبی و چوب پنبه‌ای)
- کارمن زاجی (برای تشخیص بافت‌های سلولزی)
- میكروسكوپ
- لام و لامل
- ساقه سبزی جعفری یا نعنا
- چایی صاف‌كن
بافت جانوری
- لام و لامل
- لانست
- پنبه و الكل
- رنگ‌های متیلن‌بلو و گیمسا
- میكروسكوپ
- خلال دندان
نكات ایمنی: پوشیدن دستكش فراموش نشود. تنفس آب ژاول و اسیداستیك خطرناك است؛ زیر هود و با در جایی كه تهویه مناسبی دارد كار كنید.
مراحل انجام پروژه
آزمایش اول: مشاهده سلول های مقطع عرضی ساقه گیاه
مرحله اول: برش گیری
ساقه گیاه را در صورت نیاز بشوئید و با تیغ تیز برش های باریكی تهیه كنید. ضخامت برش باید به اندازه یك لایه سلول و كاملاً عمود بر محور طولی ساقه باشد. بدین منظور از قطعه كوچكی یونولیت استفاده نمایید. قطعه را از وسط دو نیم كرده و روی یك نیمه، شکافی به اندازه قطر نمونه ایجاد كنید. نمونه را در شکاف جای دهید و نیمه دوم یونولیت را بر روی نمونه قرار داده و با انگشت شست و اشاره دو نیمه یونولیت را فشار دهید تا ساقه در میان یونولیت ثابت شود. سپس با تیغ تیز برش های نازكی از عرض ساقه تهیه كنید. دقت كنید كه برش ها عمود بر محور طولی ساقه باشد، در غیر این‌صورت چند لایه سلول در یك برش قرار گرفته و تصویر واضحی نخواهید داشت. برش ها را به ظرف شیشه ساعتی كه محتوی آب مقطر است منتقل كنید. به نظر شما علت انتقال برش ها به ظرف آب چیست؟ از آنجایی‌كه ضخامت برش ها بسیار نازك است، با از دست دادن آب در هوای آزاد خشك و مچاله شده و دیگر نمی توان از آنها استفاده كرد. حداقل 10 برش تهیه نمایید.
مرحله دوم: رنگ آمیزی
1- جهت بی رنگ كردن بافت، برش های تهیه شده را در آب ژاول20% به مدت 15 الی20 دقیقه، بسته به نوع بافت از لحاظ نرم و سفت بودن آن، قرار دهید تا برای مراحل بعدی رنگ آمیزی آماده شود.
2- سپس برش ها را با آب مقطر شستشو دهید. در این مرحله می توانید به دو شیوه عمل نمائید، در روش اول بافت ها را به وسیله قلم موی كوچكی از شیشه ساعت محتوی آب ژاول به شیشه ساعت دیگری كه محتوی آب مقطر است انتفال دهید. در روش دوم محتوی شیشه ساعت را از چایی صاف كن عبور دهید تا برش ها روی صافی باقی بمانند. سپس با مقادیر مناسب آب مقطر عمل شستشو را انجام دهید.
3- در این مرحله برش ها را به مدت 2 دقیقه به منظور خنثی نمودن خاصیت بازی آب ژاول باقی مانده در بافت گیاهی در اسید استیك 10% قرار دهید. قابل توجه است در صورتی‌كه بافت به مدت طولانی در اسید استیك بماند، متلاشی می گردد.
4- در این مرحله برش ها آماده رنگ آمیزی شده‌اند، برش ها را به مدت 5 الی 10 ثانیه در متیلن بلو قرار دهید. برای این كار برش ها را بر روی قلم موی كوچك قرار داده و به آرامی درون محلول متیلن بلو (5 تا10 ثانیه) فرو برده و سریعاً برش را به شیشه ساعتی محتوی آب مقطر منتقل كنید.
5- بعد از شستشو با آب مقطر برش ها را در اتانول 70 % به مدت 3 الی 5 دقیقه قرار داده تا رنگ اضافی متیلن بلو شسته و تنها بافت های چوبی، رنگ آبی را حفظ كنند.
6- سپس برش ها را با آب مقطر بشویید. تا این مرحله رنگ آمیزی ساده انجام شده است و نمونه را می توانید زیر میكروسكوپ مطالعه كنید. در صورتی كه بخواهید رنگ آمیزی مضاعف انجام دهید، مراحل زیر اضافه می گردد.
7- تمام برش ها را داخل محلول كارمن جهت رنگ آمیزی بافت های زنده و عموماً سلولزی به مدت 10 الی 15 دقیقه قرار دهید.
8- در انتها برش ها را با آب مقطر فراوان شستشو دهید.
9- حال نمونه آماده مشاهده و بررسی است. یك قطره آب مقطر بر روی لام قرار دهید، سپس چند تا از برش های تهیه شده را با قلم مو روی آن قرار داده و لامل را به طور مورب روی لام به آرامی بیاندازید تا حباب هوا بین لام و لامل تشكیل نشود. نمونه را زیر میكروسكوپ نوری مطالعه كنید. همچنین می توانید از تصویر ایجاد شده با دوربین عكس بگیرید.
10- در صورت نیاز به نگهداری این نمونه به جای یك قطره آب مقطر از گلیسیرین استفاده كنید و دور آنرا با لاك ناخن جهت عدم نفوذ گرد و خاك بپوشانید.
تهیه رنگ های زیستی:
محلول کارمن زاجی: ۱ گرم پودر کارمن را با ۴ گرم زاج آمونیاکی مخلوط و در ۱۰۰ سی‌سی آب مقطر حل كنید محلول را ۲۰ دقیقه جوشانده و ۱۲ ساعت آن را بی حرکت بگذارید و بعد از این زمان صاف نموده.
معرف متیلن بلو: برای تهیه محلول ذخیره ۴۸/۱ گرم مادة خشک را به ۱۰۰ میلی لیتر الکل ایزوپروپیل اضافه کنید. برای تهیه محلول کار، لازم است محلول ذخیره را به نسبت ۱ به ۱۰ رقیق کرد (۱۰میلی لیتر محلول با ۹۰ میلی لیتر آب مقطر)
معرف گیمسا: ۳ گرم پودر گیسما را در ۳۵۰ میلی‌لیتر تا ۳۷۵ میلی لیتر متانول کاملاً حل کنید سپس ۱۵۰ میلی لیتر گلسیرین به آن اضافه کنید و به مدت ۱۲ ساعت در حرارت ۳۷ درجه قرار دهید.
مطالب مرتبط:
مشاهده میكروسكوپی سلول های گیاهی و جانوری، جلسه اول
مشاهده میكروسكوپی سلول های گیاهی و جانوری، جلسه دوم
بخش پژوهش های دانش آموزی تبیان، تهیه: زینب باقری
تنظیم: زینب شاه مرادی
