یافتن تنوع اكولوژیكی میكروب ‌ها، جلسه دوم

هدف: در این پروژه می ‌خواهیم بدانیم که تنوع زیستگاهی باکتری ‌ها تا چه اندازه است و قادر به تحمل چه شرایط سختی هستند. همچنین باکتری ‌هایی که از نقاط مختلف جمع ‌آوری و کشت داده شده‌اند را از نظر شکل ماکروسکوپی و میکروسکوپی با یكدیگر مقایسه کنیم.

حداقل زمان مورد نیاز برای انجام پروژه: 2 هفته

هزینه‌ی برآوردی: كم

سطح دشواری: ساده

برای مشاهده‌ بهتر سلول‌ ها، بویژه سلول ‌های کاملا شفاف و غالباً متحرک باید آنها را رنگ کنیم به این صورت که ابتدا آنها را کشته سپس به آنها رنگ‌ هایی که به یک یا چند بخش سلول تمایل دارند اضافه می ‌کنیم. با این کار سلول‌ ها رنگ گرفته و زیر میکروسکوپ به خوبی قابل تشخیص‌اند.

رنگ ‌آمیزی باکتری ‌ها به منظور سه هدف مهم انجام می‌شود:

1- بررسی شکل باکتری: با استفاده از رنگ آمیزی ساده، منفی و گرم (Gram)

2- شناسایی از طریق جنس دیواره‌ باکتری: با استفاده از رنگ آمیزی گرم

3- بررسی ساختارهایی ویژه در باکتری: مثل رنگ ‌آمیزی تاژک، اسپور، کپسول و غیره.

با رنگ‌آمیزی گرم علاوه بر دیدن شکل باکتری‌ ها، می ‌توان جنس دیواره‌ شان را نیز تشخص داد. این روش رنگ ‌آمیزی اولین بار توسط پزشک دانمارکی به نام هنس کریستن گرم در سال 1884 ابداع شد. بین خودمان بماند که آن زمان خود گرم نفهمید که چه کار ارزشمندی انجام داده است! زیرا تصور می ‌کرد که همه باکتری ‌ها نهایتاً به یک رنگ در می ‌آیند. ولی ما امروزه می ‌دانیم که این روش، اساسی برای متمایز کردن صفات باکتری ‌ها است. با استفاده از رنگ‌آمیزی گرم، باکتری ‌ها به دو رنگ بنفش و قرمز در می ‌آیند. برحسب قرارداد، به باکتری‌ های بنفش گرم مثبت و به قرمزها، گرم منفی می ‌گویند.

جالب است بدانیم که ما از میکروسکوپ برای مطالعه باکتری ‌ها استفاده می‌ کنیم، چون فوق ‌العاده ریزند و با چشم غیرمسلح دیده نمی ‌شوند. اندازه باکتری‌ ها عموماً در حد میکرومتر است (2/0 تا 10 میکرون) اما اخیراً دانشمندان در دریای سرخ نوعی باکتری در روده یک ماهی پیدا کرده ‌اند که اندازه آن 5/0 میلی ‌متر است و با چشم غیر‌مسلح هم قابل دیدن است. به این باکتری که اپولوس نام دارد، لقب باکتری ماموتی داده ‌اند.

مواد و وسایل لازم

•  برای ساخت محیط کشت:

- ترازو با دقت دهم گرم

- اتوکلاو

- پودر محیط کشت نوترینت آگار6/5گرم

- آب مقطر 200 سی‌سی

- استوانه مدرج، ارلن 500 سی‌سی، پلیت 8 سانتی‌متری پلاستیکی 10 عدد

-  پنبه

- شعله

•  برای کشت:‌

- نمونه‌های مختلف

- فالکون

- سواب

- لوله‌ی شیشه‌ا‌ی سرکج

- اتانول 70%

- شعله

- انکوباتور

•  برای رنگ آمیزی‌:

- لام

- مداد الماس (یا ماژیک CD)

- ست رنگ آمیزی گرم (شامل: کریستال ویوله، لوگل، رنگ‌بر و سافرانین)

- میکروسکوپ و روغن ایمرسیون

روش انجام پروژه

مرحله‌ اول: ساخت محیط کشت نوترینت آگار (Nutrient Agar)

در ابتدا باید محیطی غنی درست کنید که بتوانید بیشتر باکتری‌های موجود در نمونه‌ تان را کشت دهید. برای این منظور از محیط کشت نوترینت آگار استفاده ‌کنید. پودر این محیط که حاوی مواد مغذی برای رشد میکروارگانیسم‌ها و مقداری آگار است به صورت تجاری در بازار یافت می‌ شود. اما این پودر باید به محیطی منسجم و مناسب برای رشد باکتری تبدیل شود. مراحل تهیه محیط کشت در زیر آمده است.

طرز تهیه محیط کشت جامد

مراحل کار به شرح زیر است:

1- انتخاب ظرف اولیه مناسب: از ارلنی استفاده ‌کنید که حداکثر  ²/₃  حجم آن پر شود.

2- محاسبه و توزین پودر محیط کشت: روی قوطی ‌های محیط کشت، عدد مخصوص ساخت آن نوشته شده است. به عنوان مثال عدد 28 گرم در یک لیتر درج شده است. یعنی برای تهیه 1000 سی‌سی از محیط کشت نیاز به 28 گرم از پودر آن است.

3- افزودن محیط و آب مقطر به ظرف‌: پودر محیط كشت را داخل ارلن ریخته، سپس نیمی از آب را به آن اضافه ‌كنید و پس از

هم‌زدن نیم دیگر را بیافزایید.

4- پنبه‌گذاری: برای اینکه حجم نمونه در طی حرارت دیدن و اتوکلاو تغییر نکند و همچنین برای حفظ شرایط استریل، مقداری پنبه سر ارلن بگذارید.

5- یکنواخت کردن محیط: محیط کشت‌ های مایع با همزدن یکنواخت می ‌شوند اما محیط‌ های جامد و نیمه جامد به دلیل داشتن آگار باید حرارت ببینند تا آگار آنها ذوب شده و محیط یکنواخت گردد. دقت کنید که محیط کشت‌تان در ضمن حرارت دیدن نجوشد. این ‌کار تا زمانی ادامه پیدا می ‌کند که محیط ‌تان شفاف شود.

6- استریل کردن: با اتوکلاو محیط کشت را در دمای 121 درجه‌ی‌‌سانتی ‌گراد به‌مدت 15 دقیقه استریل كنید.

7-  توزین داخل پلیت: در شرایط استریل و کنار شعله محیط‌ ها را داخل پلیت‌ های استریل بریزید.

تنها نکته قابل ذکر در تهیه‌ محیط کشت میزان پودر مورد نیاز است و با توجه به اینکه در این آزمایش نیاز به حدود 20 پلیت دارید و هر پلیت نیز حدود 20 سی‌سی ظرفیت دارد لذا می‌ بایست 400 سی‌سی محیط کشت درست کنید.  (20×20=400)  با یک جدول تناسب ساده می ‌توان محاسبه کرد که باید 8/10 گرم از پودر محیط کشت برداشت.

10/8  = ؟

بعد از درست شدن محیط، اتوکلاو کردن و توزین محیط در پلیت ‌ها، حدود 5 دقیقه بعد در دمای آزمایشگاه محیط کشت داخل پلیت می‌ بندد و حالت جامد به خود  می‌گیرد و آماده‌ کشت می ‌شود.

جعبه ابزار زیستی

پلیت (Plate)

ظرفی است دایره‌ ای شکل که از آن برای نگهداری محیط کشت میکروب و سلول استفاده می ‌شود. پلیت دارای درپوشی است که روی آن قرار می ‌گیرد. پلیت‌ ها‌ در اندازه‌های مختلف با قطر 5، 8 و 10 سانتی‌متری عرضه می ‌شوند و ارتفاع آنها 1 تا 5/1 سانتی متر می ‌باشد. این ظرف در دو جنس پلاستیکی و شیشه ‌ای وجود دارد که جنس پلاستیکی و یک بار مصرف آن در کارخانه و با اشعه گاما استریل می‌شود و جنس شیشه ‌ای آن که چند‌بار مصرف است، در آزمایشگاه هر‌بار قبل از استفاده استریل می‌شود.

* اگر پلیت پلاستیکی استریل نداشتیم چه کار کنیم؟

می ‌توان از ظروف دردار کوچک پلاستیکی که ترجیحاً شفاف هستند، استفاده کنیم و با الکل آنها را ضدعفونی کنیم و یا از لوله ‌های آزمایش استفاده کنیم که در این صورت سطح کمتری برای رشد میکروب خواهیم داشت.

گاهی در آزمایش‌ های خود نیاز به استفاده از محیط کشت مایع است. برای ساخت این محیط از پودر محیط کشت نوترینت براث (Nutrient Broth) (براث = مایع) استفاده ‌کنید و همانند روش ذکر شده محیط را بسازید اما از آنجایی كه در مواد تشكیل دهنده‌ این محیط آگار استفاده نشده است برای همگن نمودن آن نیاز به حرارت نیست. محیط مایع را به جای پلیت در لوله‌ های آزمایش بریزید و آن را در انتهای کار اتوکلاو کنید.

مطالب مرتبط:

یافتن تنوع اكولوژیكی میكروب ‌ها، جلسه اول

یافتن تنوع اكولوژیكی میكروب ‌ها، جلسه دوم

یافتن تنوع اكولوژیكی میكروب ‌ها، جلسه سوم

یافتن تنوع اكولوژیكی میكروب ‌ها، جلسه چهارم

یافتن تنوع اكولوژیكی میكروب ‌ها، جلسه پنجم

یافتن تنوع اكولوژیكی میكروب ‌ها، جلسه ششم

یافتن تنوع اكولوژیكی میكروب ‌ها، جلسه هفتم

بخش پژوهش های دانش آموزی تبیان، تهیه: مهبان رحیمی فرد

تنظیم: زینب شاه مرادی