تولید اتانول توسط قارچ ‌های میکروسکوپی، جلسه دوم

هدف: در این پروژه، به دنبال جایگزینی برای سوخت‌ های فسیلی هستیم و در این مسیر، توان تولید اتانول توسط قارچ ‌های میکروسکوپی مختلف را با یکدیگر مقایسه می‌کنیم.

حداقل زمان مورد نیاز برای انجام پروژه: 5 هفته

هزینه برآوردی: متوسط

سطح دشواری: سخت

مواد و وسایل مورد نیاز

- خمیر ترش و میوه‌ فاسد شده

- محیط کشت دارای عصاره‌ مخمر (در جدول 1 طرز ساخت آن آمده است)

- لوله آزمایش و لوله دورهام

- فیلدوپلاتین (لوپ)

- محیط کشت تخمیری الکل (بر اساس جدول 1 ساخته شود)

- آنتی بیوتیک (پنی سیلین + استرپتومایسین) و ماده‌ ضد کپک (پروپیونات سدیم)

- اتوکلاو و انکوباتور شیکر‌دار

- دی کرومات پتاسیم و اسید سولفوریک 1 نرمال

- ابزار تقطیر

روش انجام پروژه

مرحله‌ اول: جداسازی ساکارومایسز سرویزیه

محیط کشتی جهت جداسازی ساکارومایسزسرویزیه طبق دستورالعمل زیر بسازید و آن را با اتوکلاو استریل کنید.

مواد مورد نیاز برای تهیه یك لیتر از  محیط کشت تخمیری الکل

جدول 1 ساخت محیط كشت

جعبه ابزار زیستی

اتوکلاو (Autoclave)

اتوکلاو یکی از دستگاه‌ هایی است که برای استریل کردن وسایل آزمایشگاه استفاده می ‌شود. اساس کار این دستگاه بر مبنای ایجاد بخار آب گرم در فشار بالاست. اتوکلاو وسایل ما را در دمای 121 درجه سانتی‌گراد و فشار 5/1 اتمسفر در مدت 15 دقیقه استریل می‌کند.

همان‌ طور‌که در تصویر دیده می ‌شود این دستگاه به شکل استوانه است و دهانه آن به وسیله سرپوش مخصوصی که در اطراف آن گیره‌ هایی وجود دارد محکم بسته می ‌شود. روی این سرپوش درجه فشار هوا و سوپاپ بخار قرار دارد. درون این استوانه صفحه ‌ای مشبک تعبیه شده که زیر آن از آب پر می ‌شود و روی آن وسایلی که باید استریل شوند قرار می ‌گیرد.

برای به‌ کار انداختن اتوکلاو به ‌ترتیب زیر عمل ‌کنید:

1- ابتدا اتوکلاو را  تا قسمت مخصوص خود آب ‌کنید (منظور تا زیر صفحه مشبک است که در همه اتوکلاوها علامت ‌گذاری شده است).

2- وسایلی که می ‌خواهید استریل شوند را ابتدا در کیسه‌ پلاستیکی محکمی قرار داده، سپس درون اتوکلاو قرار ‌دهید و درِ آن را ‌بندید. دقت شود که گیره ‌ها محکم بسته شوند.

3- چند دقیقه ‌ای صبر کنید تا دمای اتوکلاو به 100 برسد در این زمان شیر بخار را باز ‌کنید تا هوای اشباع به همراه کمی بخار آب از آن خارج شود. زمانی که بخار اصطلاحاً به شکل دم روباه از آن خارج شد، شیر را ببندید.

4- از این زمان به بعد کم‌کم عقربه فشار سنج بالا رفته تا به 5/1 اتمسفر برسد و دما نیز در این حین به 121 درجه ‌ی سانتی ‌گراد می ‌رسد. از این زمان به بعد زمان‌سنج اتوکلاو‌های دیجیتال به کار افتاده تا 15 دقیقه کامل شود و به صورت اتومات خاموش می ‌شود. اگر دستگاه زمان‌سنج نداشت، خودتان بعد از رسیدن دمای دستگاه به 121 درجه‌ی‌سانتی ‌گراد، 15 دقیقه زمان بگیرید و بعد دستگاه را خاموش ‌کنید.

5- دستگاه را به طور کامل خاموش كنید (از برق در ‌آورید) شیر بخار آن را باز كنید و صبر كنید تا عقربه‌ فشار‌سنج به ‌صفر برسد.

6- حال می‌ توان گیره ‌های در اتوکلاو را باز کرد و وسایل خود را از آن خارج کرد.

توجه توجه!! هیچ ‌گاه قبل از رسیدن درجه اتوكلاو به صفر درِ آن را باز نكنید زیرا به علت اختلاف فشار داخل اتوكلاو و فضای آزمایشگاه، وسایل داخل اتوكلاو به بیرون پرتاب شده و بخار آب با فشار خارج می ‌شود و خدای‌ نكرده دچار سوختگی با بخار خواهید شد!

اگر اتوكلاو نداشتیم چه‌كار كنیم؟

باید دست به‌ دامان مادرمان شویم! و زودتر آشپزخانه را از او مدت كوتاهی قرض بگیریم. زودپز با بخار آب تحت فشار تا حدود زیادی وسایل ما را عاری از میكروب كند.

مخمر‌های مولد الکل را می‌توان از منابع مختلفی مانند خمیر ‌ترش، مربا ‌ها و شیرینی ‌های درحال فساد و میوه ‌های شیرین مانند خرما و انگور، جدا کرد. مخمر را در محیط جامد عصاره‌ مخمر کشت دهید.

کشت مخمر

برای جلوگیری از رشد باکتری در محیط باید از آنتی ‌بیوتیک استفاده کرد. به این ‌صورت که mg/ml60 پنی سیلین و mg/ml100 استرپتومایسین به حجم یک لیتر از محیط کشت اضافه می ‌کنید. همچنین می‌ توان mg/ml 250 پروپیونات سدیم به عنوان ضد کپک نیز به محیط اضافه کرد.

درجه حرارت مناسب برای انکوباسیون مخمرها 30 درجه‌ سانتی‌گراد  به مدت 3 تا 4 روز است.

پس از این مدت از محیط لام تهیه کرده و رنگ ‌آمیزی گرم انجام دهید. در صورت مشاهده‌ مخمر، از نمونه به روی محیط کشت مناسب خود کشت خطی دهید و در 30 درجه‌ی سانتی ‌گراد انکوبه كنید.

تصویر میکروسکوپی مخمر

مرحله‌ دوم : ارزیابی فعالیت تخمیری در مخمر جدا شده

ابتدا مخمر جدا سازی شده را تست كنید تا اگر فعالیت تخمیری و در نتیجه قابلیت تولید الکل داشت، آنوقت در محیطی بزرگتر برای تولید الکل بیشتر آن را كشت دهید.

برای این کار به تعداد انواع مخمرهای جدا شده لوله‌ های آزمایش در نظر بگیرید. ابعاد لوله ‌ها باید حدودا 200 در 25 میلی ‌متر باشد تا بتوان درون آن 35 میلی ‌لیتر محیط کشت مایع ریخت و لوله ‌ای به اندازه‌ 50 در 10 میلی‌متر نیز در آن جا شود. به لوله‌ کوچک درونی لوله دورهام (Dorham tube) گفته می ‌شود. این لوله را به صورت وارونه درون لوله اول قرار می ‌دهند به طوری که پر از محیط کشت شود و هیچ گونه حباب هوایی درون آن وجود نداشته باشد. به این ترتیب اگر باکتری کشت شده توانایی تولید گاز داشته باشد، در این لوله جمع می‌ شود و شما می‌ توانید گاز تولیدی را به صورت حباب مشاهده كنید (تصویر سمت راست شکل 3).

در این پروژه هر مخمری كه میزان گاز CO2 بیشتری تولید کند یعنی فعالیت تخمیری بیشتری داشته و در نتیجه قابلیت تولید الکل بالاتری خواهد داشت. لذا برای این سنجش، ابتدا محیط کشت تخمیری الکل که طرز تهیه آن در جدول شماره یک آمده است را، درست كنید.

بعد از مخلوط کردن مواد ذکر شده آنها را در لوله ‌های آزمایش ریخته، لوله دورهام وارونه به آن اضافه کرده و بعد از پنبه ‌گذاری در اتوکلاو قرار دهید تا لوله ‌های حاوی محیط کشت و لوله دورهام استریل شوند.

بعد از این مرحله هر سویه مخمر جدا شده را در یک لوله آزمایش کشت دهید و به مدت 48 ساعت در 30 درجه‌ی سانتی ‌گراد انکوبه كنید.

کشت با لوله دورهام

مطالب مرتبط:

تولید اتانول توسط قارچ ‌های میکروسکوپی، جلسه اول

تولید اتانول توسط قارچ ‌های میکروسکوپی، جلسه دوم

تولید اتانول توسط قارچ ‌های میکروسکوپی، جلسه سوم

تولید اتانول توسط قارچ ‌های میکروسکوپی، جلسه چهارم

بخش پژوهش های دانش آموزی تبیان، تهیه: مهبان رحیمی فرد

تنظیم: زینب شاه مرادی