یافتن بهترین نگهدارنده طبیعی برای فرآورده های گوشتی، جلسه سوم
حداقل زمان مورد نیاز برای انجام پروژه: 8 هفته
هزینه برآوردی: متوسط
سطح دشواری: سخت
ادامۀ روش کار...روش دوم- درست کردن چاهک
تنها تفاوت این روش با روش قبلی در این است که به جای درست کردن دیسک، بر روی محیط جامد چاهک هایی درست می کنیم و درون آن از عصارهی ادویه های مورد آزمایش میریزیم.
چاهک ها را به قطر حدوداً 5 میلیمتر با شیئی نوک تیز که قبلاً آن را روی شعله استریل کردهاید، ایجاد كنید و دو قطره از هر عصاره را در کنار شعله در هر چاهک بریزید.
این بار نیز بعد از دو روز انکوبه کردن هاله عدم رشد ایجاد شده را بررسی كنید.
روش سوم - مخلوط کردن با محیط
زمانی که محیط کشت جامد را درست میكنید بعد از مرحله حرارت دادن و ذوب آگار، محیط را در چند ارلن جداگانه ریخته و به جز یک ظرف در باقی آنها مقدار 10 سیسی از عصاره های گیاهی مختلف را اضافه كنید. به این ترتیب یک ارلن حاوی محیط کشت به عنوان شاهد و چند ارلن حاوی محیط کشت و عصاره های گیاهی خواهید داشت. سر ظرف ها را پنبه گذاشته و اتوکلاو كنید. بعد از پلیت ریزی و بستن محیط ها از باکتری های رشد یافته در محیط مایع، 1 سیسی توسط سرنگ انسولین (یا به کمک پیپت استریل) برداشته و روی محیط کشت بریزید.
برای پخش کردن باکتری ها نیز میتوان از میله شیشه ای سرکج که قبلاً با الکل و شعله استریل شده است، استفاده نمود.
میله شیشهای برای پخش باکتری
بعد از دو روز انکوباسیون، میزان رشد باکتری ها را بررسی كنید.
اگر غلظت سوسپانسیون باکتریایی کم بوده و با میله نیز خوب پخش شده باشد، میتوانید کلنی ها را بر روی محیط جامد شمارش کنید و مقایسه پلیت ها را به صورت تعداد کلنی گزارش دهید. اما در صورت مشخص نبودن کلنی ها به طور جداگانه، فقط می توان کیفی بیان کرد که رشد در محیط ادویهدار کمتر از کنترل شده یا نه و نیز ادویه های مختلف را با هم مقایسه کرد.
مرحله سوم: تیمار گوشت با ادویه
تا بدین جای پروژه یک یا چند ادویه ای که توانایی از بین بردن باکتری های گوشت را دارند، پیدا کردهاید. یکی از آنها که بسیار مؤثر بود، سیر است. این ماده علاوه بر اثر آنتی باکتریال اثر آنتی اکسیدانی نیز دارد لذا به عنوان نگهدارنده بسیار مناسب است (شما هم می توانید بهترین ادویه خود را که جواب گرفته اید در این قسمت آزمایش کنید).
در ادامه 8 تكه گوشت قرمز (حدودا هر تكه 5 گرم) را به دو گروه 4 تایی تقسیم كنید. گروه 1 را با عصارهی سیری که درست کردهاید، تیمار كنید. برای این کار عصاره را بر سطح گوشت اسپری كنید. به 4 تکه دیگر که قرار است گروه کنترل باشند، آب مقطر استریل اسپری کنید تا شرایط مشابه شستشوی گوشت توسط عصاره سیر را برای این گروه نیز ایجاد كرده باشید و هر دو گروه در شرایط یکسان با یکدیگر مقایسه شوند. سپس هر تکه را جداگانه بسته بندی کرده و بر روی آنها برچسب مشخصات شان را بزنید. با این توضیحات که کدام تیمار شده با سیر و کدام تیمار نشده است و علاوه بر آن تاریخ روزی که قرار است برای شمارش باکتری از یخچال خارج شوند را نیز بنویسید. تاریخ ها به صورت 2، 4، 6 و 8 روز بعد نوشته می شوند. بعد از گذشت مدت زمان نوشته شده برای هر تکه گوشت، آنها را از یخچال خارج كرده و هر قسمت را در یک لوله آزمایش قرار دهید. در شرایط استریل و در کنار شعله به هر لوله 15 میلیلیتر سرم رینگر استریل اضافه كنید؛ درِ لوله ها را با چوب پنبه و پارا فیلم بسته و خوب تکان دهید تا باکتری های سطح گوشت، کاملا با آب مقطر مخلوط شوند. بعد از آن، اقدام به شمارش باکتریها نمایید.
لازم به ذکر است که نتیجه ای قابل قبول است که حاصل برایند 20 بار تکرار آزمایش در این قسمت باشد.
مرحله چهارم: شمارش باكتری ها
برای شمارش، راه های بسیار متنوعی وجود دارد که در اینجا با سه راه آن آشنا میشوید.
1- شمارش میکروسکوپی از طریق لام توما یا نئوبار
این روش، روش شمارش مستقیم به شمار می رود که در آن از لام های توما و یا نئوبار استفاده میشود. این دو نوع لام دارای خطوط و تقسیم بندی های بسیار ریزی هستند که زیر میکروسکوپ این تقسیمات قابل تشخیصاند.
در وسط این نوع لامها قسمتی وجود دارد که به اندازه 02/0 میلیمتر از سایر قسمت های لام پایینتر است. در قسمت فرو رفته لام یک مربع به 400 مربع کوچک تقسیم بندی شده است که مساحت هر مربع 0025/0 میلی متر مربع است.
پس از قرار دادن لامل بر سطح لام، حجم هرکدام از مکعب مستطیل های کوچک برابر است با : 0.00000005 (8-10 × 5) سانتی متر مکعب.
شمارش باکتری ها به این صورت است که ابتدا به یك سیسی سوسپانسیون میکروب یك سیسی محلول1/0 % آبی متیلن اضافه كنید تا باکتری ها زیر میکروسکوپ به خوبی دیده شوند. سپس لوله را خوب تکان داده و همگن نمایید. با یک لوپ تمیز از سوسپانسیون برداشته، بر روی لام گذاشته و لامل را روی آن قرار دهید. دقت شود که تمام قسمت داخلی لام باید از سوسپانسیون باکتری پوشیده شده باشد.
تقسیمبندی لام نئوبار
یکی از خانه های وسطی 16 مربعه را در نظر بگیرید و باکتری های هر مربع را بشمارید و در آخر بین 16 خانه میانگین بگیرید و تعداد باکتری های میانگین را بر حجم آن خانه، یعنی 8-10 × 5 ، تقسیم كنید تا تعداد باکتری ها در یک سانتیمتر مکعب از سوسپانسیون بدست آید.
به عنوان مثال اگر به طور میانگین در هر یک از مربع های کوچک 4 باکتری باشد:
4 باکتری | 10*5 سی سی |
؟ | 1 سی سی |
107× 8 =X
چون این سوسپانسیون به نسبت 1 به 1 با آبیمتیلین رقیق شده بود عدد بالا را بر 2 تقسیم میكنیم.
107×4 باکتری در 1 سانتیمتر مکعب سوسپانسیون وجود دارد.
نکته اگر تعداد باکتری ها زیاد و غیر قابل شمارش بود، محلول را رقیق کرده و آخر كار تعداد را در عکس ضریب رقت، ضرب كنید.
نكته برای شمارش سلول های بزرگتر مثل گلبول های سفید خون یا برخی تك سلولی ها، از 4 مرجع 1 × 1 كناری كه تقسیمات ریزتر را ندارند استفاده میشود.
مطالب مرتبط:
یافتن بهترین نگهدارنده طبیعی برای فرآوردههای گوشتی، جلسه اول
یافتن بهترین نگهدارنده طبیعی برای فرآوردههای گوشتی، جلسه دوم
یافتن بهترین نگهدارنده طبیعی برای فرآوردههای گوشتی، جلسه سوم
یافتن بهترین نگهدارنده طبیعی برای فرآوردههای گوشتی، جلسه چهارم
یافتن بهترین نگهدارنده طبیعی برای فرآوردههای گوشتی، جلسه پنجم
یافتن بهترین نگهدارنده طبیعی برای فرآوردههای گوشتی، جلسه ششم
یافتن بهترین نگهدارنده طبیعی برای فرآوردههای گوشتی، جلسه هفتم
بخش پژوهش های دانش آموزی تبیان، تهیه:مهبان رحیمی فرد
تنظیم: زینب شاه مرادی