استفاده از نانو کامپوزیت ابریشم

دهمین دوره از پروژه های دانش آموزی تبیان نیز با یاری خداوند و حضور پر شور شما دوستان و علاقمندان به پایان رسید اما کار ما هنوز تمام نشده است! این دوره نیز همچون سال های گذشته دوستان بسیاری با ثبت طرح ها و ایده های خلاقانه خود در منوی "پیشنهاد موضوع" ما را در ارتقای تنوع پروژه ها یاری نموده‌اند. هم چون گذشته بر آن شدیم تا با گردآوری این ایده های جالب، علاوه بر قدر دانی از این دوستان نوآور، زمینه ای را برای ایده پروری سایر پژوهشگران علاقمند فراهم آوریم. فراموش نکنید که ما همیشه منتظر طرح های جدید شما عزیزان هستیم.

نام ایده: استفاده از نانو کامپوزیت ابریشم/ نقره برای ترمیم بافت استخوانی

نام ارائه دهنده/دهندگان: فاطمه متقی طلب
زمینه و نوع پروژه: عملی/ نانوبیوتکنولوژی
درجه سختی: دشوار
نام مدرسه: فرزانگان 1

امروزه، یکی از بزرگ‌ترین چالش هایی که در علوم مختلف پزشکی مطرح است نحوه ترمیم بافت آسیب دیده می باشد. در همین راستا، ترمیم بافت استخوانی به دلیل نوع ساخته و ترکیبات تشکیل دهنده آن بسیار مورد توجه قرار گرفته است. تا به امروز، از روش های مختلفی برای ترمیم بافت استخوانی استفاده شده است که از آن جمله می توان به روش های اتولوگ، زنوگرافت و... اشاره نمود. روش اتولوگ رایج‌ترین روشی است که برای ترمیم بافت آسیب دیده استخوان مورد توجه بسیاری از متخصصین است.

با این وجود، به دلیل محدودیت هایی از جمله نیاز به عمل جراحی ثانویه، عفونت های پس از جراحی و ایجاد واکنش ایمنی، محققان برآن شدند که از روش های جایگزین استفاده نمایند. مهندسی بافت، توانمندترین روش برای ساخت داربست های 3 بعدی بر پایه‌ نانو کامپوزیت های طبیعی به منظور ترمیم بافت استخوانی می باشد.
 
کامپوزیت ترکیبی است که از لحاظ ماکروسکوپی از چند ماده متمایز ساخته شده باشد، به طوری که این اجزاء به آسانی از یکدیگر قابل تشخیص باشند. به طور نمونه، یکی از کامپوزیت های آشنا بتن است که از دو جزء سیمان و ماسه ساخته شده است.
 
نانوکامپوزیت نیز همان کامپوزیت است که یک یا چند جزء از آن، ابعاد کمتر از 100 نانومتر دارد. نانوکامپوزیت ها از دو فاز تشکیل شده‌اند. فاز اول یک ساختار بلوری است که در واقع پایه یا ماتریس نانوکامپوزیت محسوب می شود و ممکن است از جنس پلیمر، فلز و یا سرامیک باشد. فاز دوم نیز ذراتی در مقیاس نانومتر می باشند که به عنوان تقویت کننده (مواد پرکننده Filler) به منظور اهداف خاص از قبیل استحکام، مقاومت، هدایت الکتریکی، خواص مغناطیسی و... در درون فاز اول (ماده پایه) توزیع می شوند.

تا به امروز، از روش ها و پلیمرهای مختلفی برای ساخت نانوکامپوزیت ها استفاده شده است که از آن جمله می توان به هیدروکسی آپاتایت، کیتوزان، PLGA و... اشاره نمود. در این میان، استفاده از پلیمرهای طبیعی به دلیل نرخ زیست سازگاری و زیست تخریب پذیری مناسب، بسیار مورد توجه قرار گرفته است. ابریشم پلیمری طبیعی با زیست سازگاری انعطاف پذیر و خواص مکانیکی مناسب است که به دلیل خواص ذکر شده، گزینه ای مناسب جهت ساخت داربست استخوانی می باشد.

هدف اصلی پروژه حاضر استفاده از نانو کامپوزیت ابریشم/ نانوذرات نقره جهت کاهش میزان آلودگی و عفونت در ناحیه آسیب دیده می باشد. لذا دانش آموزان جهت دستیابی به اهداف پروژه و ساخت نانو کامپوزیت ابریشم /نانو ذرات نقره از روش Freeze-drying استفاده کردند. دانش آموزان مراحل زیر را به ترتیب انجام دادند.

1. تهیه محیط کشت DMEM
2. آماده کردن سرم جنین گاو
3. تهیه محلو ل Trypsin/EDTA
4. تهیه رنگ تریپان بلو
5. تهیه محلول PBS بدون كلسیم و منیزیم
6. تهیه محلول كلاژناز 05/0%
7. آماده کردن پارافرمالدهید X10
8. آماده سازی سرم آلبومین (BSA) 1%
9. تهیه محلول 0.1% Triton
10. آماده کردن محلول MTT
11. تعیین زیست پذیری سلول ها با استفاده از MTT assay
12. بررسی ریخت شناسی سلول ها بر روی داربست
13. بررسی میزان چسبندگی سلول ها بر روی داربست

طرز تهیه محیط كشت DMEM
ابتدا 10 گرم پودر DMEM حاوی ال-گلوتامین را توسط ترازوی حساس وزن كرده؛ به ارلن حاوی 900 میلی لیتر آب دی یونیزه اضافه كرده؛ 3/7 گرم پودر بی‌كربنات سدیم به آن اضافه می شود. به محلول فوق 100 میلی گرم استرپتومایسین و 6 میلی گرم به ازای هر لیتر پنی سیلین (1mg=1668U) اضافه كرده؛ پس از انحلال كامل به حجم 1000 میلی لیتر رسانده شد. با استفاده از Hcl 1 مولار، pH را در 2/7 تنظیم كرده و محیط كشت را در زیر هود با استفاده از فیلتر 0/22 میكرون ضد عفونی و در 4 درجه سانتیگراد نگهداری شدند.

روش آماده كردن سرم جنین گاو
در این پژوهش از سرم جنین گاو FBS استفاده شد. برای غیر فعال كردن كمپلمان موجود در آن از بن ماری با دمای 56 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه استفاده شد.

روش تهیه محلول Trypsin/EDTA
پس از تهیه پودر تریپسین و EDTA، مقدار 0/25 گرم پودر تریپسین و 0/30 گرم پودر EDTA را در 100 میلی لیتر بافر فسفات حل کرده تا محلولی با غلظت تریپسین  0/25 در صد و 1 میلی مولار EDTA به دست آید. پس از مخلوط كردن محلول های فوق با نسبت 1 به 1، محلول به دست آمده را در لوله های فالكول به صورت 5 میلی لیتر تقسیم كرده و در دمای 20 – درجه سانتی گراد نگهداری شدند.

روش تهیه رنگ تریپان بلو
400 میلی گرم پودر تریپان بلو را وزن كرده و با آب مقطر به حجم 100 میلی لیتر رسانده، سپس محلول حاصل را از صافی عبور داده؛ برای ممانعت از رشد قارچ در آن چند بلور سدیم آزید افزوده شد.

روش تهیه محلول PBS بدون كلسیم و منیزیم
پس از تهیه قرص های PBS،5 عدد از قرص ها را در 90 میلی لیتر آب دی یونیزه حل شد. پس از انحلال كامل حجم به 1000 میلی لیتر ‌رسانده شد. محیط كشت را در فضای زیر هود با استفاده از فیلتر 0/22 میكرون ضد عفونی كرده و در ظروف شیشه‌ای در پیچ دار در 4 درجه سانتیگراد نگهداری شدند.

روش تهیه محلول كلاژناز 05/0%
پس ازتهیه پودر كلاژناز تیپ IΙ، 50 میلی گرم از آن را با 100 میلی لیتر محیط DMEM حل كرده و محلول فوق در زیر هود لامینار با استفاده از فیلتر 0/22 میكرون ضد عفونی شد.

نحوه آماده کردن پارافرمالدهید X10
 40 گرم پارافرمالدهید را به 100 میلی لیتر PBS اضافه كرده سپس محلول فوق بر روی همزن مغناطیسی با دمای 60 درجه سانتی گراد قرار داده شد تا حل شود (حدود 4 ساعت).

روش آماده سازی سرم آلبومین (BSA 1%)
برای این منظور، دانش آموزان حدود 1 گرم از پودر BSA را وزن کرده و در 100 میلی لیتر PBS به طور کامل حل نمودند تا محلول فوق تهیه شد.

روش تهیه محلول 0.1% Triton
 برای این منظور، دانش آموزان حدود 1/0 گرم از پودر Triton را وزن کرده و در 100 میلی لیتر PBS حل نمودند تا محلول فوق تهیه شد.

 نحوه آماده کردن محلول MTT
50 میلی گرم از پودر MTT در 10 میلی لیتر PBS حل شده تا محلول ذخیرهMTT (5mg/ml)  تهیه شد.

تعیین زیست پذیری سلول ها با استفاده از MTT assay
MTT ماده ای است که به طور طبیعی به رنگ زرد دیده می شود. در صورت زنده بودن سلول ها، نمک Tetrazolium وارد میتوکندری آن ها شده و توسط آنزیم سوکسینات دی هیدروژناز به ماده فرمازان بنفش رنگ تبدیل خواهد شد.

فرمازان ایجاد شده پس از انحلال در محلول ایزوپروپانول با دستگاه Eliza Plate Reader تعیین می شود. در ضمن شدت رنگ ایجاد شده نشان دهنده میزان سلول های زنده خواهد بود. بنابراین در این مطالعه، ابتدا داربست های ساخته شده را با استفاده از اشعه فرابنفش استریل نموده، داخل چاهک های پلیت 96 خانه قرار داده شدند.

سپس، حدود 103×5 سلول در هر یک از چاهک های پلیت ریخته و حدود 100 میکرولیتر محیط کشت DMEM حاوی 10% FBS به هر یک از چاهک ها اضافه شد. سپس پلیت در داخل انکوباتور قرار گرفت.

در روزهای 3، 7 و 14 محیط کشت را به طور کامل خارج کرده، به جای آن حدود 100 میکرولیتر (MTT (5mg/ml را بر روی سلول ها ریخته، به مدت 4 ساعت در داخل انکوباتور قرار داده شدند. بعد از این زمان، MTT خارج شد و به جای آن 100 میکرولیتر ایزوپروپانول برای حل شدن رسوب سیاه رنگ فرمازان بر روی چاهک های حاوی سلول ها به مدت 15 دقیقه ریخته شد.

برای حل شدن بهتر رسوب فوق، پلیت بر روی دستگاه شیکر قرار داده شد. در نهایت با استفاده از دستگاه Eliza Plate Reader در طول موج 570 نانومتر میزان تغییرات رنگی مورد ارزیابی قرار گرفت.

بررسی ریخت شناسی سلول ها بر روی دابست
آزمون ذکر شده به منظور بررسی ریخت شناسی سلول ها بر روی داربست انجام گرفت. ابتدا 103×5 سلول به همراه حداقل میزان محیط کشت بر روی هریک از بسترها به مدت 2 ساعت برای چسبیدن ابتدای قرار داده شد. بعد از اتصال اولیه سلول ها با سطح بسترها، حدود 3 میلی لیتر محیط کشت به هر یک از چاهک های پلیت 24 خانه که بسترهای مورد نظر در آن ها واقع شده بود، اضافه گردید.

در پایان 10 روز کشت سلول ها بر روی بستر، پارافرم آلدهید 4% را به مدت 15-30 دقیقه به منظور تثبیت سلولی بر روی سلول ها ریخته و سپس نمونه ها را با استفاده از درصدهای مختلف الکل (100%، 95، 90، 85، 80، 70، 50، 30، 10) آبگیری کردند و در نهایت برای تهیه تصاویر میکروسکوپ الکترونی پوشش طلا بر روی بسترها داده شد.

بررسی میزان چسبندگی سلول ها بر روی داربست
به منظور بررسی میزان چسبندگی سلول ها بر روی داربست از روش قرمز خنثی استفاده شد. کلیه مراحل این روش مشابه سنجش MTT بوده با این تفاوت که در این روش به جای محلول MTT آر محلول Neutral red و به جای ایزوپروپانول از محلولی حاوی 1% اسید استیک، 49% آب و 50% اتانول استفاده می شود.

مهارت های کسب شده

1- استخراج ابریشم
2- ترکیب نانوذرات نقره و پلیمر ابریشم
3-  ساخت نانوکامپوزیت سه بعدی با استفاده از روش Freeze-drying
4- بررسی زیست سازگاری و خواص مکانیکی بررسی خواص فیزیکی و ساختاری داربست
5- ترمیم استخوان آسیب دیده با شبیه سازی ساختار طبیعی استخوان در شکستگی های وسیع

بخش پژوهش های دانش آموزی تبیان، تهیه:مهدی رحمانی
تنظیم:علی سرمدی