سه شنبه 3 اسفند 1395 - 24 جمادي الاول 1438 - 21 فوريه 2017

جداسازی باکتری های تولید کننده آنتی بیوتیک از خاک، جلسه اول

برای اینکه بتوانیم باکتری ها را کشت داده و آزمایشات مورد نظرمان را انجام دهیم لازم هست تا آنها را پرورش دهیم! برای این کار قدم اول تهیه محیط کشت جامد برای تغذیه و رشد باکتری هاست....
عکس نویسنده
عکس نویسنده
نویسنده : بدون نویسنده
بازدید :
زمان تقریبی مطالعه :
جداسازی باکتری های تولید کننده آنتی بیوتیک از خاک، جلسه اول
جداسازی باکتری های تولید کننده آنتی بیوتیک از خاک_ جلسه اول


تهیه ی محیط کشت میکروبی جامد

اهداف جلسه

برای اینکه بتوانیم باکتری ها را کشت داده و آزمایشات مورد نظرمان را انجام دهیم لازم هست تا آنها را پرورش دهیم! برای این کار قدم اول تهیه محیط کشت جامد برای تغذیه و رشد باکتری هاست.


 وسایل مورد نیاز

محیط کشت نوترینت آگار، ارلن، پلیت استریل، ترازو، آب مقطر.

   هزینه: زیاد

محیط های کشت میکروب ها را از یک نگاه می توان به محیط های کشت انتخابی و افتراقی تقسیم کرد.
بعضی از محیط های مغذی دارای یک عامل انتخابی هستند که ویژه جداسازی یا کشت گروه خاصی از میکروب هاست . عامل انتخابی معمولا با جلوگیری از رشد ارگانیسم های دیگر عمل می کند و از این راه موجب رشد شدیدتر ارگانیسم های مورد نظر می شوند. وقتی عامل انتخابی به محیط کشت اضافه می شود در این صورت محیط کشت را انتخابی می گویند.

محیط های کشت افتراقی اجزایی دارند که موجب می شوند برخی از ارگانیسم ها در مقایسه با باکتری های دیگری که درهمان محیط کشت رشد می کنند به شکل متفاوتی ظاهر شوند. مجموعه ای از باکتری ها که در روی محیط کشت کنار هم رشد می کنند بر اثر رشد و تکثیر، تشکیل نقاط برجسته ای روی محیط کشت می دهند این نقاط را کلنی می نامند.
برای آشنایی با محیط کشت های مختلف و کاربرد آنها، تعدادی از انها را معرفی می کنیم:
محیط آگارخوندار
محیط کشت آگار خوندار یکی از محیطهای کشت مغذی است که رشدبسیاری ازباکتریها راتامین می کندوهمچنین ایجاد همولیز برروی این محیط به راحتی قابل بررسی است. برای تهیه این محیط پس از اتوکلاو محیط پایه، هنگامی که درجه آن تا حدود 50 درجه سانتیگراد رسید، خون گاو را به نسبت 5 تا 7 درصد به آن اضافه نموده و با رعایت شرایط استریل در پلیت های استریل می ریزند.


محیط شکلاتی
محیط کشت آگار شکلاتی که درآن گلبولهای قرمز به صورت لیز شده وجوددارد ازمحیط های کشت مغذی است که رشداغلب باکتری ها راتامین می کند. برای تهیه این محیط پس ازتهیه آگارپایه گه همان پایه آگارخوندار است کافی است که خون دردرجه حرارت هشتاد درجه سانتیگراد به محیط اضافه شود. در این محیط بعلت اینکه گلبول های قرمز خون در اثر حرارت متلاشی شده و اجزای آن خارج گشته، برای رشد باكتری هایی نظیر هموفیلوس و نایسریاها که نیاز بیشتری به مواد غذایی آماده دارند مناسب می باشد.


محیط مولر هینتون
این محیط به عنوان یک محیط مغذی پایه برای بررسی آنتی بیوگرام مناسب است برای تهیه این محیط پس ازحل نمودن پودر محیط درآب مقطر و اتوکلاونمودن محیط رادرپلیت های استریل تقسیم می کنند.


محیط EMB
این محیط از رشدباکتری های گرم مثبت جلوگیری می کندوبه عنوان یک محیط انتخابی پایه برای جداسازی باکتری های گرم منفی بسیار مناسب است. کلنی Ecoli برروی این محیط به صورت جلای فلزی یا درخشندگی متالیک ظاهر می گردند که کلید تشخیصی باکتری Ecoli نسبت به سایر باکتری های روده ای می باشد.

 

محیط مک کانکی آگار
در این محیط از رشدباکتری های گرم مثبت جلوگیری می شود و به عنوان یک محیط انتخابی پایه برای جداسازی باکتری های گرم منفی مناسب است. کلنی ها  بر حسب استفاده باکتری ازلاکتوز بصورت لاکتوزمثبت (صورتی) و لاکتوز منفی (بی رنگ) ظاهر می شوند. رنگ ارغوانی کلنی های باکتری های لاکتوز مثبت مربوط به واکنش اسیدی است که در نتیجه تخمیر قند لاکتوز در مجاورت املاح صفراوی و جذب نوترال رد حاصل شده است. معرف نوترال رد در محیط قلیایی بی رنگ و در محیط اسیدی قرمز رنگ است.
 این محیط انتخابی وافتراقی است که ارگانیسم های گرم منفی رشد كرده وگرم مثبت ها به علت وجود نمك صفراوی و كریستال ویوله رشد نمی کنند.


محیط مانیتول سالت آگار
در این محیط به علت حضور 7.5% نمک از رشد بسیاری از باکتری ها جلوگیری شده ولی اساتفیلو کوک ها به خوبی رشد می نماید. این محیط هم چنین حاوی قند مانیتول و معرف فنول رد می باشد و در صورتی استافیلوکوک مورد نظر قادر به تخمیر مانیتول باشد باعث اسیدی شدن محیط و تغییر رنگ معرف به زرد می شود.


محیط SIM
از این محیط برای بررسی حرکت باکتری توانایی احیای گوگرد و تولید SH2 و تست اندول استفاده می شود. حرکت باکتری به واسطه پخش شدن آن از مسیر خط کشت به اطراف و کدر نمودن محیط مشخص می گردد. باكتری های فاقد حرکت تنها مسیر خط کشت را که نمایان است، کدر می کنند. ایجاد هیدروژن سولفوره توسط باکتری به صورت سیاه شدن محیط ظاهر می گردد. ظهور رنگ ارغوانی در سطح کشت دلیل بر تولید ایندول توسط باکتری است.


محیط کشت سابور دکستروز آگار
محیط انتخابی برای تکثیر قارچ ها می باشد که بسیاری از باكتری ها نیز در این محیط رشد می کنند. انتخابی بودن این محیط برای قارچ ها بر اساس PH پایین و هم چنین مواد غذایی ناچیز آن است.


روش کار:
با توجه به توضیحات داده شده درباره انواع محیط کشت و هدفی که از کشت باکتری داریم ، نوع محیط کشت را انتخاب میکنیم. ما برای جداسازی باکتری های موردنظر خود از خاک به یک محیط مغذی مانند نوترینت آگار نیاز داریم، که یک محیط مناسب برای رشد بیشتر باکتری هاست و به صورت جامد است. برای تهیه محیط کشت با پودر نوترینت آگار به صورت زیر عمل کنید:


1- از ارلنی استفاده می کنیم که حداکثر 3/2 حجم آن پر شود.
2- روی قوطی های محیط کشت عدد مخصوص ساخت آن نوشته شده است. مثلا در مورد این محیط نوشته شده است 28 گرم در یک لیتر. ما در این آزمایش نیاز به حدود 10 پلیت داریم. هر پلیت هم حدود 20 سی سی ظرفیت دارد لذا می خواهیم 200 سی سی محیط کشت درست کنیم.  با یک جدول تناسب ساده می توان محاسبه کرد که باید 6/5 گرم از پودر محیط کشت برداشت.   

  5/6 = ؟

 

3- محیط را داخل ارلن ریخته سپس نیمی از آب (100 سی سی) را افزوده، هم می زنیم بعد نیم دیگر را اضافه می کنیم.
4- برای اینکه حجم نمونه در طی حرارت دیدن و اتوکلاو تغییر نکند و هم چنین برای حفظ شرایط استریل، مقداری پنبه سر ارلن می گذاریم.
5- محیط کشت های مایع با همزدن یکنواخت می شوند اما محیط های جامد و نیمه جامد به دلیل داشتن آگار باید حرارت ببینند تا آگار آنها ذوب شود و محیط یکنواخت شود. دقت کنیم که محیط کشت مان در ضمن حرارت دیدن نجوشد. این کار تا زمانی ادامه پیدا می کند که محیط مان شفاف شود. مثل درست کردن ژله.
6- با اتوکلاو محیط کشت را در دمای 121 درجه به مدت 15 دقیقه استریل می کنیم. (در جلسه بعدی این مرحله توضیح داده می شود.)
7- در شرایط استریل و کنار شعله محیط ها را داخل پلیت های استریل می ریزیم.
بعد از 5 دقیقه در دمای آزمایشگاه که محیط کشت داخل پلیت می بندد و حالت جامد به خود  می گیرد محیط هایی آماده برای کشت خواهیم داشت.
گاهی در آزمایش های خود نیاز به محیط کشت مایع داریم. برای ساخت این محیط از پودر محیط کشت نوترینت براث (براث=مایع) استفاده می کنیم و به روش بالا محیط را می سازیم با این تفاوت که چون این محیط در خود آگار ندارد برای همگن کردن آن نیازی به حرارت نداریم (مرحله 5). محیط مایع را به جای پلیت در لوله های آزمایش می ریزیم و آن را در انتهای کار اتوکلاو می کنیم.

مطالب مرتبط:
جداسازی باکتری های تولید کننده آنتی بیوتیک از خاک- جلسه اول
جداسازی باکتری های تولید کننده آنتی بیوتیک از خاک_ جلسه دوم
جداسازی باکتری های تولید کننده آنتی بیوتیک از خاک_ جلسه سوم
جداسازی باکتری های تولید کننده آنتی بیوتیک از خاک_ جلسه چهارم
جداسازی باکتری های تولید کننده آنتی بیوتیک از خاک_ جلسه پنجم

 بخش پژوهش های دانش آموزی تبیان، تهیه: زینب باقری

 

تلفن : 81200000
پست الکترونیک : public@tebyan.com
آدرس : بلوارکشاورز ، خیابان نادری ، نبش حجت دوست ، پلاک 12

ارتباط با ما

روابط عمومی

درباره ما

نقشه سایت

تعدادبازدیدکنندگان
افراد آنلاین