تبیان، دستیار زندگی
در طرح وسترن بلات4 در مورد لیز کردن سلول و دسترسی به پروتئین با هم آشنا شدیم. اما پروتئین های بدست آمده را باید به شکل محلول در آورد. برای محلول سازی پروتئین ها از آنجایی که توالی اسیدهای امینه هر کدام با هم متفاوت است بنابراین باید حلال مناسب برای ...
عکس نویسنده
عکس نویسنده
بازدید :
زمان تقریبی مطالعه :

وسترن بلات 5

اهداف:

  • آشنایی با محلول کردن پروتئین ها
  • آشنایی با روش های تعیین غلظت پروتئین ها

شرح درس

در طرح "وسترن بلات4" در مورد لیز کردن سلول و دسترسی به پروتئین با هم آشنا شدیم. اما پروتئین های به دست آمده را باید به شکل محلول در آورد. برای محلول سازی پروتئین ها از آن جایی که توالی اسیدهای امینه هر کدام با هم متفاوت است بنابراین باید حلال مناسب برای هر پروتئین انتخاب شود.

محلول کردن پروتئین ها

برای این منظور از کائوتروپ ها، شوینده ها و واکنش گرهای احیاء کننده استفاده می شود که در زیر مختصرا به آن ها اشاره می شود:

کائوتروپ ها:

"اوره" برای از بین بردن پیوندهای هیدروژنی استفاده می شود که منجر به باز شدن و دناتوره شدن پروتئین می گردد. در مقابل، نشان داده شده که "تیواوره" برای شکستن بر هم کنش های هیدروفوب مناسب تر است ولی حلالیت پایین آن در آب استفاده از آن را محدود کرده است ( البته حلالیت آن در محلول محتوی اوره بیشتر است. ). در حال حاضر بهترین محلول برای محلول سازی پروتئین های هیدروفوب ترکیبی از اوره 8-5 مولار و تیواوره 2 مولار می باشد.

اما بزرگ ترین مشکل در استفاده از اوره تعادل آن با آمینیوم (ایزو) سیانات است که منجر به تغییر PH طبیعی پروتئین شود.

شوینده ها:

برای جلوگیری از برقراری بر هم کنش های هیدروفوب بین جایگاه های های هیدروفوب پروتئین ها از شوینده ها استفاده می شود. چنین بر هم كنش هایی می توانند منجر به از دست دادن پروتئین ها بر اثر رسوب دادن یا تجمع یافتن شوند.

ترکیبات احیا کننده:

برای جلوگیری از اکسیداسیون دوباره پیوندهای دی سولفید استفاده می شوند. با استفاده از این واکنشگرها پیوندهای دی سولفید بین مولکولی و درون مولکولی شکسته می شوند و پروتئین کاملاً باز می شود. 2-مركاپتواتانول احیا كننده معروفی است كه امروزه با معرفی تركیبات جدیدتری كه می توانند در غلظت های پایین تر موثر باشند دیگر كمتر در الكتروفورز دو بعدی مورد استفاده قرار می گیرد.

تعیین غلظت پروتئین

کمی سازی محتویات پروتئینی یک نمونه فرآیندی مهم است و کاربردهای وسیعی در آزمایش های تشخیص طبی و تحقیقات، به خصوص در زمینه ی بیوشیمی دارد. کمی سازی دقیق نمونه ی پروتئینی مرحله ی حیاتی در آنالیز پروتئینی به حساب می آید. در طی دو دهه ی گذشته، تکنیک های متفاوتی برای سنجش غلظت نمونه های پروتئینی به وجود آمده است. روش های اسپکتروسکوپی رایج ترین روش ها برای کمی سازی غلظت نمونه های پروتئینی به شمار می آیند. روش های متداولی که برای کمی سازی پروتئین به کار میرود به شرح زیرند:

Lowry protein assay

روشی بیوشیمیایی برای تعیین مقدار پروتئین موجود در یک محلول، که بر اساس واکنش یون مس با باند های پپتیدی پروتئین می باشد. بر مبنای تغییر رنگ حاصله غلظت پروتئین سنجیده میشود.

Biuret test

در این تست شیمیایی باند های پپتیدی در محیط بازی با یون مس کامپلکس تشکیل می دهند و محلول متمایل به بنفش می شود، افزایش در شدت رنگ بنفش نشانه ی افزایش غلظت پروتئین است.

وسترن بلات

Bradford protein assay

روش بردفورد از انواع روش های رنگ سنجی برای تعیین غلظت پروتئین است و بر خلاف دو روش قبلی، باند شدن کوماسی با پروتئین باعث تغییر رنگ آن از قهوه ای مایل به قرمز به آبی شده و شدت رنگ آبی نشانه ی بالا بودن غلظت پروتئین نمونه است.


مرکز یادگیری سایت تبیان - تهیه: فاضل صحرانشین سامانی

تنظیم: مریم فروزان کیا