همان طور که ذکر شد برخی تکنیک های بررسی پروتئین نیاز به این دارند که غشای سلول از بین برود تا بتوان به محتوای پروتئینی داخل سلول دسترسی داشت. ...
عکس نویسنده
عکس نویسنده
بازدید :
زمان تقریبی مطالعه :

وسترن بلات 4

اهداف:

 

  • آشنایی با روش های لیز کردن سلول برای تکنیک وسترن بلات
  • آشنایی با برخی نکات مهم در استخراج و تهیه نمونه وسترن بلات

 

شرح درس:

همان طور که ذکر شد برخی تکنیک های بررسی پروتئین نیاز به این دارند که غشای سلول از بین برود تا بتوان به محتوای پروتئینی داخل سلول دسترسی داشت. روش های مختلفی برای از بین غشای سلول وجود دارد که بسته به نوع بافت و یا قوام سلول می توان یک و یا ترکیبی از این روش ها را انتخاب کرد.

 

در جدول ذیل برخی از متداول ترین این روش ها آورده شده است.

 

 

آماده سازی نمونه پروتئینی برای وسترن بلات

نحوه آماده سازی نمونه ها یک نکته کلیدی برای به دست آوردن نتایج خوب می باشد. چند نکته مهم برای آماده سازی نمونه ها در ادامه آمده است:

 

  • جلوگیری از آلودگی های محیطی
  • استفاده از روش های انتخابی برای آنالیز بافت
  • جلوگیری از حذف نمونه اصلی هنگام آماده سازی
  • خنک نگه داشتن نمونه ها در هنگام آماده سازی
  • کوتاه کردن مدت نگهداری تا حد امکان
  • حذف نمک ها

 

غیر فعال سازی یا حذف مواد مداخله گر

در طی لیز سلول و یا بعد از آن باید ترکیبات مداخله کننده از قبیل آنزیم های پروتئولیتیک، نمک ها، لیپیدها، اسیدهای نوکلئیک، پلی ساکاریدها، را حذف و یا غیر فعال کرد.

 

1) غیر فعال کردن پروتئازها:

برای این منظور می توان از مهار کننده ها استفاده کرد.

 

2) حذف یون های نمکی:

یون های نمکی می توانند با جداسازی الکتروفورتیک نمونه ها مداخله کنند و بنابراین در صورتی که غلظتشان خیلی زیاد باشد (>100mM ) باید آن ها را حذف کرد. برای حذف نمک می توان از حلال های آلی (از قبیل استون سرد) و یا کیت های تجاری استفاده کرد.

 

3) حذف لیپیدها:

مقادیر بالای لیپید می تواند با پروتئین های غشایی بر همکنش برقرار کند و جانشین شوینده ها شود. استفاده از حلال های آلی (از قبیل اتانول یا استون سرد) می تواند به حذف لیپید از نمونه های غنی از چربی (مثل بافت مغزی) کمک کند. به علاوه سانتریفیوژ دور بالا و به دنبال آن حذف لایه لیپیدی نیز می تواند مورد استفاده قرار گیرد.

 

4) حذف پلی ساکاریدها و اسیدهای نوکلئیک:

این ترکیبات علاوه بر این که می توانند با آمفولیت های حامل و پروتئین بر همکنش کنند، می توانند ویسکوزیته محلول را بالا ببرند و منافذ ژل را پر کنند. بنابراین حتی در غلظت های پایین هم باید این ترکیبات را حذف کرد. روش متداول، رسوب دهی پروتئین ها با استون یا TCA/ استون است.

 


مرکز یادگیری سایت تبیان - تهیه: فاضل صحرانشین سامانی

تنظیم: مریم فروزان کیا