وسترن بلات 3

اهداف:

• آشنایی با روش های مختلف تشخیص آنتی ژن در وسترن بلات

شرح درس:

وسترن بلات یکی از تکنیک های است که بر اساس واکنش آنتی بادی و آنتی ژن کار می کند. بنابراین پس از انتقال پروتئین از غشا به بلات باید از آنتی بادی های اولیه و ثانویه برای شناسایی آن استفاده کرد. آنتی بادی اولیه نوعی از آنتی بادی است که به آنتی ژن مورد نظر ما به طور اختصاصی متصل خواهد شد. این آنتی بادی به خودی خود از خود نوری نداشته و بنابراین باید آنتی بادی دوم و یا ثانویه ای انتخاب کرد که به طور اختصاصی به آنتی بادی اولیه متصل شود.

رنگ آمیزی پروتئین جهت شناسایی آنتی ژن

در این روش پروتئین های متصل به ایمونوبلات به طور مستقیم به وسیله رنگ های ارگانیک (مانند آمیدوبلاک، فاست گرین و کوماسی بلو) و نشاندارهای فلورسنت، شناسایی می شوند.

شناسایی ایمونولوژیکی آنتی ژن

به طور کلی دو روش برای شناسایی پروتئین ها پس از اضافه کردن آنتی بادی اولیه وجود دارد که شامل روش های رادیواکتیو و نیز مواد متصل به آنزیم می شود.

شناسایی کمی لومینسنت آنتی ژن ها

با توجه به حساسیت و قدرت انتخابی ذاتی، کمی لومینسنت برای شناسایی باندهای پروتئینی روی فیلم اشعه ایکس با کاوشگرهای نشاندار رادیواکتیو مورد استفاده قرار گرفته است. این روش نیازی به یک منبع القایی مانند فلورسنس ندارد و تنها به یک شناسایی کننده نور مانند یک تیوب چند وجهی نوری نیاز دارد.

روش کمی لومینسنس به اندازه روش اسپکتروسکوپی عملی نیست ولی در عین حال محدودیت های شناسایی این روش در قیاس با دیگر تکنیک های لومینسنس می تواند 10 تا 100 برابر کمتر باشد. اکثر روش های کمی لومینسنس شامل استفاده از تعداد کمی مواد شیمیایی برای ایجاد نور می شود. در کمپلکس لومینال که به طور وسیعی مورد بررسی قرار گرفته، یک ماده به طور شیمیایی اکسید می شود تا یک محصول تحریک شده تولید کند. در بسیاری از روش های لومینول این محصول تحریک شده است که نور را برای ایجاد سیگنال منتشر می کند.

در ایمونوبلات ها پس از اتصال آنتی بادی ثانویه ای که با آلکالین فسفات و یا پراکسیداز هورس-رادیش ( (HRP آمیخته شده)، مواد به آن ها اضافه می شود. آلکالین فسفات دفسفریلاسیون مواد کمی لوسنسی را تسریع می کند که منجر به ایجاد نور می شود.

توضیح فیلم:

پروتئینی که با غلظت مناسب از سلول آماده شده است در میدان الکتریکی رو ژل حرکت داده می شود. سپس روی بلات انتقال داده شده و برای ردیابی همراه با آنتی بادی اولیه که فاقد رنگ است، ردیابی می شود. آنتی بادی اولیه تمایل زیادی به اتصال به آنتی ژن داشته و بنابراین می توان به راحتی آنرا توسط آنتی بادی ثانویه ردیابی نمود.

برای دریافت این فایل آموزشی کلیک کنید.

امروزه از دستگاه های مخصوص تصویر برداری که دارای فیلتر کمیلومینسنس می باشد استفاده می شود. حساسیت این دستگاه ها از فیلم کمتر است ولی در عوض تصویر تمیزتر، قابلیت تنظیم تصویر کسب شده، تصویر برداری با دینامیک بالاتر و استفاده از نرم افزار برای آنالیز از مزایای این روش به شمار می روند. با استفاده از این سوبستراها شناسایی پروتئین های با بیان بسیار کم نیز امکان پذیر می شود. با این حال باید توجه داشت که در این روش ممکن است زمینه عکس تاریک شود و نیز باندهای غیر اختصاصی روی تصویر ظاهر گردد.

شناسایی بیش از یک آنتی ژن روی یک بلات

اما روی یک بلات تا چند آنتی ژن را می توان بررسی کرد؟ امکان شناسایی ترتیبی آنتی ژن های مختلف روی یک بلات وجود دارد البته بدون این که نیاز به حذف آنتی بادی ها باشد. بلات های پروتئینی به وسیله روش های استاندارد به کمک غشاهای نیتروسلولوزی و یا نایلونی تهیه می شوند که با استفاده از کمی لومینسنس تحریک شده و در معرض قرار دادن فیلم اشعه ایکس روی آن انجام می گیرد. حداقل 12 نوع آنتی بادی مختلف با استفاده از این روش می تواند به کار گرفته شود، از آنجایی که پروتئین های متصل به غشا از آن جدا نمی شوند، مشخص شده شدت سیگنال تولیدی برای همه آنتی بادی های مورد استفاده قوی است.

وسترن رنگین کمان

این روش در واقع روشی تغییر یافته از شناسایی آنتی ژن چندگانه است که در آن چهار ماده پراکسیداز هوورس-رادیش که می توانند رنگ های قهوه ای، مشکی، قرمز و سبز تولید کنند برای شناسایی همزمان چهار آنتی ژن مورد استفاده قرار می گیرند.

شناسایی پروتئین ها با استفاده از آویدین-استرپتاویدین

از اختصاصی بودن اثر متقابل بین ویتامین بیوتینکه وزن مولکولی پایینی دارد (224) و پروتئین آویدین برای افزایش دقت شناسایی استفاده شده است. آنتی بادی ها و پروتئین های دیگر به آسانی می توانند با بیوتین آمیخته شده و به عنوان یک عامل شناسایی ثانویه برای بلات پروتئین ها مورد استفاده قرار گیرند. در مرحله سوم بلات با فرایندی که شامل آمیخته شدن آویدین با یک آنزیم گزارشگر مناسب مانند ای پی و یا گلوکز اکسیداز است مشاهده می گردد. از آنجایی که استرپتاویدین استخراج شده از قارچ استرپتومایسیس آویدینی گلایکوزیله می باشد و اسیدیته نزدیک به خنثی دارد این نوع استرپتاویدین جایگزین آویدین سفیده تخم مرغ شده است.

مرکز یادگیری سایت تبیان - تهیه: فاضل صحرانشین سامانی

تنظیم: مریم فروزان کیا