روش های آشکار سازی محصولات PCR در Real-time PCR

اهداف:

• آشنایی با راه کارهای آشکارسازی محصولات PCR
• آشنایی با رنگ های موجود در کمی سازی داده های PCR

شرح درس:

تا این مرحله ما cDNA ساخته شده توسط PCR را به همراه پرایمر ادر اختیار داریم و مطمئن شده ایم که روی ژل آگارز باند مربوط به ژن مورد مطالعه را داریم. حال نوبت به کمی سازی این داده توسط دستگاه Real-Time می شود.

به طور کلی آشکار سازی محصولات PCR در real-time PCR به صورت اختصاصی و غیر اختصاصی انجام می گیرد.  روش غیر اختصاصی با کمک رنگ فلورسانس SYBR Green انجام می شود که این رنگ به تمام انواع DNA های دو رشته ای اعم از محصولات اختصاصی و غیر اختصاصی PCR و پرایمر-دایمر ها متصل می گردد.

روش اختصاصی آشکار سازی با کمک پروب های نشاندار شده با مواد فلورسانس که ویژه توالی هستند انجام می گردد که می توان پروب های TaqMan و پروب های هیبریدیزاسیون را نام برد.

رنگ SYBR Green I

رنگ SYBR Green I نیز مانند اتیدیوم بروماید از جمله اینترکالیتورها می باشد و به DNA دو رشته ای متصل می گردد با این تفاوت که حساسیت بیشتری نسبت به اتیدیوم برماید دارد و واکنش PCR را مهار نمی سازد. در طول PCR رنگ SYBR Green I به هر نسخه جدید از DNA دو رشته ای متصل می گردد و متناسب با مقدار محصول دو رشته ای تولید شده در واکنش PCR شدت فلورسانس ناشی از اتصال SYBR Green I نیز افزایش می یابد ماکزیمم تحریک و انتشار رنگ SYBR Green I به ترتیب در 494 نانومتر و 521 نانومتر می باشد و برای استفاده با هر real-time cycler سازگار است.

رنگ SYBR Green I بررسی چندین هدف مختلف را بدون نیاز به سنتز پروب های ویژه هدف امکان پذیر می سازد. با این حال سیگنال حاصل از محصولات غیر اختصاصی PCR و پرایمر-دایمرها نیز به سیگنال فلورسانس اختصاصی افزوده می گردد. بنابراین هنگام استفاده از رنگ SYBR Green I بهینه سازی بالای واکنش PCR مورد نیاز است.

در سنجش کمی با استفاده از SYBR Green علاوه بر الگوی هدف، یک کنترل بدون الگو نیز ضروری است. برای آشکار کردن محصولات اختصاصی و غیر اختصاصی از برخی سنجش های پس از PCR مانند منحنی افتراقی (dissociation curve) یا ژل الکتروفورز استفاده می شود.

داده های حاصل از منحنی افتراقی نشان می دهد که دمای ذوب محصولات غیر اختصاصی تولید شده در غیاب الگو پایین تر از دمای ذوب محصولات اختصاصی تولید شده با الگوی هدف است. این حالت، شاخص تشکیل پرایمر-دایمر است و نشان دهنده این است که غلظت پایین تر پرایمر نتایج بهتری فراهم می کند. لازم به ذکر است که سنجش های تأییدی مانند نمودار پراکندگی و بررسی ژل آگارز در پایان هر واکنش آمپلی فیکاسیون real-time با استفاده از رنگ SYBR Green بسیار مفید است. زیرا تنها راهی است که محصولات اختصاصی تولید شده در طول PCR را از محصولات غیر اختصاصی (مثل پرایمر- دایمرها و ...) تمیز می دهد.

نمودار پراکندگی که به صورت مشتق شدت فلورسانس محصولات PCR علیه دما تهیه شده است، تمام محصولات اختصاصی یک Tm یکسان را نمایش می دهد، در حالی که محصولات غیر اختصاصی دارای Tm های متفاوت هستند. معمولاً پرایمر -دایمرها دارای Tm پایین تری از محصولات اختصاصی می باشند.

توضیح فیلم:

DNA دو رشته ای تحت تاثیر گرما به حالت تک رشته ای در آمده و با کاهش دما پرایمر ها به جایگاه مخصوص خود متصل شده و با به کارگیری نوکلئوتیدها کار تکثیر شروع می شود. رنگ SYBR Green به رشته های تازه سنتز شده متصل شده و در مجموع فلورسنت کلی نشان دهنده میزان تکثیر است. هر چه بیشتر باشد نور بیشتری به وجود می آید.

پروب های ویژه توالی نشاندار شده با مواد فلورسانس

کاربرد پروب های نشاندار شده با مواد فلورسانس یک روش آشکار سازی اختصاصی با حساسیت بالا فراهم می سازد. به طوری که فقط محصول PCR دلخواه قابل مشاهده می گردد و سایر محصولات غیر اختصاصی ساخته شده در واکنش آشکار نمی گردد. با این حال میزان بهینه سازی واکنش PCR نیز قابل اهمیت است. بنابراین هنگام استفاده از پروب های نشان دار شده با مواد فلورسانس در واکنش real-time PCR علاوه بر طراحی پرایمر های اختصاصی ژن، نیازمند طراحی پروب اختصاصی ژن نیز هستیم.

مرکز یادگیری سایت تبیان - تهیه: فاضل صحرانشین سامانی

تنظیم: مریم فروزان کیا