تبیان، دستیار زندگی
در اکثر موارد، برای بررسی RNA، یک بررسی کیفی به تنهایی کافی نیست. یک مسئله عمومی که در بررسی بیان ژن مطرح می شود کمی سازی رونوشت های یک ژن خاص و آشکار سازی تغییر میزان بیان آنها تحت شرایط آزمایشی مختلف است. ...
عکس نویسنده
عکس نویسنده
بازدید :
زمان تقریبی مطالعه :

کمی سازی بیان ژن بوسیله RT- PCR

اهداف:

  • آشنایی با کمی سازی بیان ژن
  • آشنایی با اهمیت کمی سازی بیان ژن

چکیده:

در اکثر موارد، برای بررسی RNA، یک بررسی کیفی به تنهایی کافی نیست. یک مسئله عمومی که در بررسی بیان ژن مطرح می شود کمی سازی رونوشت های یک ژن خاص و آشکار سازی تغییر میزان بیان آن ها تحت شرایط آزمایشی مختلف است.

real-time RT-PCR امکان کمی سازی دقیق مقادیر شروع کننده از جمله cDNA و RNA هدف را فراهم می سازد. میزان فلورسانس در طول هر سیکل اندازه گیری می شود که به شدت رنج دینامیک واکنش را افزایش می دهد، زیرا مقدار فلورسانس متناسب با مقدار محصول PCR است. محصولات PCR را می توان با استفاده از رنگ های فلورسانس که به DNA دو رشته ای متصل می شوند یا با استفاده از پروب های نشاندار شده با مواد فلورسانس که ویژه توالی هستند قابل سنجش کرد. مرحله RT برای کمی سازی دقیق و صحیح، دارای اهمیت بسیاری می باشد و مقدار cDNA تولید شده باید دقیقاً نمایانگر مقدار RNA ورودی باشد. بنابراین رنج دینامیک، حساسیت و اختصاصی بودن آنزیم، اولین ملاحظاتی هستند که باید برای یک سنجش RT-PCR موفق در نظر گرفته شوند.

لینک فیلم:

  • زیست شناسی کمی سازی بیان ژن بوسیله RT- PCR
  • توضیح فیلم: پس از ساخت cDNA، برای کمی کردن داده ها همراه با پرایمرها و محلول Taq و رنگ مخصوص به دستگاه Real-Time داده می شوند. در نهایت گراف هایی شبیه به نمودار پایین مشاهده می گردد.

    موفقیت در RT-PCR کمی به میزان زیادی به کیفیت RNA بستگی دارد. شواهدی وجود دارد مبنی بر این که محصول cDNA حاصل از توالی های نزدیک به انتهای 5’ mRNA هایی که به طور جزیی تجزیه شده اند، به طور قابل توجهی کمتر از محصول cDNA حاصل از توالی های نزدیک به دم پلی A می باشند. بر اساس این منطق برخی روش های سنجش به منظور شناسایی RNA تجزیه شده در حال توسعه می باشند. با این حال نکته قابل توجه این است که آمپلی فیکاسیون real-time RT-PCR توالی هایی به کوچکی 60bp را نیز در بر می گیرد. بنابراین تکنیک مذکور برای سنجش کمی محتوای mRNA در نمونه های بافتی حاوی RNA نسبتاً تجزیه شده مناسب می باشد. تعیین غلظت صحیح کل+ (total RNA) RNA) خصوصاً برای کمی سازی مطلق مقادیر mRNA بسیار قابل اهمیت است.

    تعیین غلظت RNA با کمک روش های سنتی از قبیل اندازه گیری جذب در OD260 توسط اسپکتروفتومتر انجام می گردد. روش های جدیدتر سنجش غلظت RNA براساس استفاده از رنگ هایی است که با اتصال به اسید های نوکلئیک و تشدید فلورسانس عمل می کنند و این افزایش شدت فلورسانس در یک اسپکتروفلوریمتر قابل سنجش می باشد. اساس آشکار سازی محصولات در تمام دستگاه های real-time بر اساس سیگنال فلورسانس می باشد. افزایش شدت فلورسانس با افزایش محصول آمپلی فای شده در طول PCR نسبت مستقیم دارد. مولکول های فلورسانس نور را به صورت فوتون در یک دامنه کوتاه طول موج نوری جذب می کنند.

    طول موجی که در آن رنگ فلورسانس نور را به صورت ماکزیمم جذب می کند طول موج تحریکی نامیده می شود. به دنبال تحریک، مولکول فلورسانس به یک سطح انرژی بالاتر برده می شود که این سطح انرژی موقتی است. مولکول تحریک شده سریعاً به سطح انرژی پایه برمی گردد. هنگامی که این اتفاق می افتد، فوتون های نوری در طول موج بالاتری منتشر می شوند. این تغییر بین طول موج های تحریکی و نشری Stoke’s shift نامیده می شود.

    برای هر رنگ فلورسانس یک طول موج تحریکی و نشری بهینه وجود دارد. یک مولکول فلورسانس می تواند در یک رنج کوتاه از طول موج ها در اطراف این نقطه اپتیمم تحریک و قابل آشکار سازی گردد. مولکول های فلورسانس با Stoke’s shift بزرگتر مطلوب تر هستند. به طوری که به آسانی امکان تفکیک طول موج تحریکی از طول موج نشری را فراهم می کند. یک نیازمندی در سنجش فلورسانس این است که تا حد امکان شدت سیگنال اولیه و نهایی یعنی قبل و بعد از آمپلی فیکاسیون با هم اختلاف زیادی داشته باشند، که این را دلتای سنجش می نامند.

    تمام سنجش های فلورسانس استفاده شده برای real-time این دلتا را با استفاده از Fluorescensce Resonanse Energy Transfer یا FRET به دست می آورند. انتقال انرژی به وسیله FRET به دو مولکول نیاز دارد که بتوانند با یکدیگر برهم کنش داشته باشند، حداقل یکی از آن ها باید قادر به نشر فلورسانس باشد.

    مولکول فلورسنت، دهنده و مولکول دوم پذیرنده نامیده می شود. در طول FRET رنگ فلورسنت دهنده توسط یک منبع نوری خارجی با طول موج تحریکی بهینه یا نزدیک به آن، تحریک می گردد و سپس در یک طول موج بلندتر نور منتشر می سازد به جای این که این نور نشری به وسیله دستگاه آشکار گردد، برای تحریک یک مولکول پذیرنده به کار می رود که از لحاظ فیزیکی نزدیک مولکول دهنده قرار گرفته است.

    مولکول پذیرنده انرژی نور نشری را از رنگ دهنده جذب می کند و به طور موثری سیگنال مولکول دهنده را خاموش می سازد. طول موج منتشر شده توسط مولکول دهنده باید نزدیک ماکزیمم جذب مولکول پذیرنده باشد. مولکول پذیرنده ممکن است نور منتشر کند یا نکند. به طور خلاصه سه نوع مولکول فلورسانس در real-time RT-PCR استفاده می شود که بر اساس عملکردشان در سنجش، نام گذاری شده اند؛ رنگ دهنده یا گزارشگر که سیگنال فلورسانس حاصل از آن در طول آزمایش نمایش داده می شود. مولکول پذیرنده یا خاموش کننده که مسئول خاموش کردن سیگنال گزارشگر است. مولکول سوم، رنگ مرجع غیر فعال است که معمولاً برای تمام واکنش ها مشترك بوده و با اجزاء واکنش برهمکنش نمی کند.

    در پایان از آزمایشگاه های موسسه تحقیقاتی رویان و آزمایشگاه مولکولی رویان تشکر می کنم که همراهی مناسبی در تهیه این مقاله داشتند.


    مرکز یادگیری سایت تبیان - تهیه: فاضل صحرانشین سامانی

    تنظیم: مریم فروزان کیا