آنزیم نسخه بردار معکوس

اهداف:

• آشنایی با انواع آنزیم نسخه بردار معکوس
• آشنایی با اهمیت آنزیم نسخه بردار معکوس

کمی سازی RNA با ساختن cDNA توسط نسخه بردار معکوس آغاز می گردد. دو نوع نسخه بردار معکوس ویروسی AMV یا Avian myeloblastosis Virus و MMLV یا Moloney murine leukemia virus موجود می باشد.

هر دو آنزیم دارای فعالیت RNase H هستند که توانایی تخریب RNA در هیبرید های RNA-DNA را دارد. در هر دو آنزیم این فعالیت از فعالیت DNA پلیمرازی تفکیک می گردد. دمای بهینه برای فعالیت AMV و MMLV طبیعی به ترتیب 42 درجه سانتیگراد و 37 درجه سانتیگراد و دمای بهینه برای فعالیت AMV و MMLV تغییر یافته به ترتیب 58 درجه سانتیگراد و 55 درجه سانتیگراد است.

به این ترتیب به نظر می رسد که برای ساختن cDNA ، AMV تغییر یافته مناسب تر از MMLV باشد. اما در عمل دیده شده که MMLV تغییر یافته خیلی بهتر کار می کند.

دلیل آن خیلی روشن نیست اما چنین مطرح می شود که هر چند دمای بالای PCR، فعالیت پلیمرازی هر دو نوع آنزیم را از بین می برد، اما توانایی اتصال به DNA حفظ می شود و ممکن است یک سد فیزیکی برای Taq پلیمراز در طول PCR ایجاد گردد. پایداری دمایی و ماهیت دیمری AMV ممکن است دلیل کاربرد کمتر آن در real-time PCR باشد.

دانشمندان نشان دادند که هر دو آنزیم در یک روش وابسته به غلظت دارای خاصیت مهار کنندگی برای PCR هستند. بنابراین باید حداقل غلظت نسخه بردار معکوس برای کسب مقدار بهینه از cDNA استفاده گردد. در عمل مقدار نسخه بردار معکوس مورد نیاز برای پرایمرهای اختصاصی ژن (GSP) کمتر از پرایمرهای تصادفی یا OligodT است. چرا که مقدار کل cDNA ساخته شده و نیز پیچیدگی آن بسیار کمتر است. باید به این نکته توجه داشت که حتی اگر هیچ پرایمری هم به مرحله RT اضافه نگردد، ممکن است cDNA به واسطه خودآغازکنندگی (در نتیجه ایجاد ساختارهای ثانویه درون مولکول RNA) ساخته شود.

روش های آغاز کننده

اختصاصی بودن RT-PCR مستقیماً به روش آغاز کننده مورد استفاده بستگی دارد. پرایمر اختصاصی ژن، پرایمر OligodT و پرایمر تصادفی که همگی به عنوان پرایمرهای مورد استفاده در روش های آغازکننده برای مرحله RT عمل می کنند. همراه با هر کدام از روش های آغاز کننده، یک نسخه بردار معکوس، واکنش را کاتالیز می کند. در زیر مزایا و معایب سه روش آغاز کننده به صورت مقایسه ای آمده است.

1- پرایمر OligodT

پرایمر OligodT با دم پلی A که در انتهای 3 پریم اکثر mRNA های یوکاریوتی یافت می شوند، هیبرید می گردد. بزرگترین مشکلی که در ارتباط با پرایمر OligodT وجود دارد این است که آغازکنندگی را به ناحیه ای نزدیک به دم پلی A محدود می سازد. برای رونوشت های طویل (برخی بالغ بر15kb) اجباراً سنجش باید درون ناحیه ترجمه نشده انتهای(3’ UTR)3’  انجام گردد. این حالت دو اشکال دارد، یکی این که احتمال طراحی پرایمرها در اگزون های متفاوت کاهش می یابد و دیگر این که در برخی از رونوشت ها توالی UTR معمولاً بسیار غنی از AT است و بنابراین برای طراحی یک سنجش PCR خیلی مناسب نیست.

2- پرایمرهای تصادفی

این مشکل با استفاده از پرایمرهای تصادفی حل می شود. اما با این حال پرایمرهای تصادفی از rRNA و tRNA ها هم cDNA می سازند که ممکن است تجمع یافته و مخلوط cDNA را پیچیده نماید. بنابراین احتمال شکست آغازکنندگی در طول PCR افزایش می یابد. اما این احتمال هم وجود دارد که پرایمرهای تصادفی مورد استفاده در مرحله RT، در طول مرحله PCR به ناحیه مکمل خود درون قطعه هدف متصل گردند که احتمالاً این امر موجب حذف آن قطعه هدف از آشکارسازی می گردد.

3- پرایمرهای اختصاصی ژن

حالت سوم استفاده از پرایمرهای اختصاصی ژن (GSP) می باشد، در واقع GSP همان پرایمر راست واکنش PCR است که در مرحله RT برای سنتز cDNA به کار می رود. شاید استفاده از GSP ها بهترین انتخاب باشد. با این حال این نوع سنجش دو اشکال عمده دارد. اول این که نمونه RNA ی زیادی لازم است. به طوری که در هر واکنش RT فقط می توان برای یک ژن سنجش انجام داد و دوم این که نمی توان از آن در واکنش های مخلوط ( بیش از یک جفت پرایمر در یک واکنش PCR) استفاده کرد. بنابراین مناسب ترین روش آغاز کنندگی باید توسط محقق و بر اساس مقدار الگوی موجود و نوع سنجش تعیین گردد.

مرکز یادگیری سایت تبیان - تهیه: فاضل صحرانشین سامانی

تنظیم: مریم فروزان کیا