وب سایت موسسه فرهنگی و اطلاع رسانی تبیان
وب سایت موسسه فرهنگی و اطلاع رسانی تبیان
سه شنبه 3 اسفند 1395 - 24 جمادي الاول 1438 - 21 فوريه 2017
برای انجام یک PCR، به زبان ساده مقدار اندکی DNA الگو همراه محلول بافری ساده ای شامل DNA پلیمراز، پرایمرهای اولیگو نوکلئوتیدی ، د اُکسی نوکلئوتیدها (dNTPs) وکوفاکتورMgCl2 به لوله آزمایش اضافه می شود. ...
عکس نویسنده
عکس نویسنده
بازدید :
زمان تقریبی مطالعه :

مکانیسم PCR

اهداف:

 

  • آشنایی با مکانیسم عمل PCR
  • آشنایی با مراحل PCR

 

چکیده:‌

برای انجام یک PCR، به زبان ساده مقدار اندکی DNA الگو همراه محلول بافری ساده ای شامل DNA پلیمراز، پرایمرهای اولیگو نوکلئوتیدی، د اُکسی نوکلئوتیدها (dNTPs) و کوفاکتور MgCl2 به لوله آزمایش اضافه می شود.

 

مخلوط PCR حاصل، از چرخه های تکراری زیر عبور می کند:

 

  • یک تا چند دقیقه در 93-95oC  ،که طی آن DNA دو رشته ای به تک رشته ای واسرشته می شود.
  • یک تا چند دقیقه در55-70 oC   ،که طی آن پرایمر ها به توالی مکمل خود روی توالی هدف متصل می شوند.
  • یک تا چند دقیقه در 72oC   ، که طی آن DNA پلیمراز ها به پرایمر ها متصل می شوند و مکمل رشته DNAی الگو را می سازند.

طی هر چرخه PCR ، نخست رشته های DNA ی الگو توسط حرارت از هم باز می شوند. به این ترتیب که حرارت سبب می شود پیوندهای هیدروژنی بین جفت بازهای دو رشته DNA شکسته شوند. این فرآیند واسرشتگی denaturation نامیده می شود، سپس دمای واکنش تا دمای اتصال annealing پایین آورده می شود.

 

در این فاز پرایمر های اولیگونوکلئوتیدی، توالی های مکمل خود را روی DNA ی الگو پیدا می کنند و به آن متصل می شوند. این تنها دمایی است که در یک سیکل PCR می تواند متغیر باشد. در نهایت DNA پلیمراز، دی اکسی نوکلئوتیدهای (dNTPs) مکمل رشته الگو را به انتهای 3خ„-OH پرایمر اضافه می کند. این فرآیند دردمای72C.  (دمای بهینه برای فعالیت اکثر DNA پلیمرازها از جمله Taq DNA پلیمراز) انجام می پذیرد.

 

 

توضیح فیلم:

 رشته DNA توسط حرارت از هم باز شده و سپس دما کاهش یافته تا پرایمرها به رشته DNA متصل شوند سپس دی اکسی نوکلئوتیدها به انتهای پرایمر اضافه می شوند و کپی های جدید شکل می گیرند.

 

 

نمونه ای که طی مرحله نخست چرخه PCR سنتز می شود بزرگتر از قطعه مورد نظر است چرا که رشته های تازه سنتز شده تنها از یک انتها توسط پرایمر محدود شده اند. در چرخه بعدی در ابتدا چهار رشته خواهیم داشت؛ دو رشته الگو و دو رشته ای که در چرخه اول سنتز شده اند. با اتصال پرایمرها به توا لی مکمل خود بر روی رشته های تازه سنتز شده، در پایان چرخه دوم قطعه مورد نظر amplified product که از دو انتها توسط پرایمر محدود شده است، ساخته می شود.

 

از این چرخه به بعد است که افزایش لگاریتمی قطعه هدف مشاهده می شود. می توان این تکثیر لگاریتمی توالی مورد نظر را به یک دستگاه فتوکپی DNA تشبیه کرد. تعداد چرخه هایی که برای هر واکنش PCR در نظر گرفته می شود بستگی به کاربرد آن دارد و به طور معمول 40-25 بار تکرار می شود.

 

مراحل PCR

PCR طی سه مرحله پیش می رود:

: (early cycles)-E فاز ابتدایی که طی آن پرایمر ها توالی های مکمل خود را جستجو می کنند. در عمل، این مرحله زیاد طول نمی کشد، چرا که نسخه های زیادی از هر پرایمر در مخلوط واکنش موجود است. بدین ترتیب احتمال پیدا کردن ناحیه مکمل زیاد است.

 

: (mid cycles)-Mدر فاز میانی PCR با تکثیر لگاریتمی قطعه موردنظر روبه رو هستیم. در این مرحله هر چه واکنش پیش می رود، تعداد نسخه هایی که توالی هدف را دارند هم بیشتر می شود به همین سبب پرایمرها از شانس بیشتری برای پیدا کردن توالی مکمل خود برخوردار هستند.

 

: (late cycles or plateau)-Lبا سپری شدن فاز لگاریتمی واکنش به یک فاز شبه خطی و در نهایت به پلاتو می رسد. عواملی در رسیدن به این فاز موثرند از جمله در دسترس بودن سوبستراها الیگونوکلئوتیدها و پرایمرها، غیر فعال شدن دمائی thermal inactivation و محدودیت غلظت آنزیم DNA پلیمراز، جلوگیری از فعالیت آنزیم در نتیجه افزایش پیرو فسفات ها، تمایل اتصال رشته های مکمل به یکدیگر در غلظت بالا (بیش از10-8 M ) و در پی آن خروج محصولات اختصاصی از واکنش و تجمع محصولات غیر اختصاصی کاهش در کارایی واسرشتگی هر سیکل تخریب محصولات به علت فعالیت اگزونوکلئازی 5 پریم به 3 پریم آنزیم Taqپلیمراز.

 

برای دستیابی به یک PCR موفق (خصوصا در مطالعات نیمه کمی ) انجام واکنش در فاز لگاریتمی بسیار قابل اهمیت است.بر این اساس برای هر جفت پرایمر، فاز لگاریتمی تعیین می گردد. بدین ترتیب که محصول واکنش در سیکل های 20 تا 40 مورد بررسی قرار می گیرد و نمودار سینتیک آن رسم می شود. با داشتن این اطلاعات می توان واکنش را قبل از رسیدن به مرحله پلاتو متوقف کرد.


مرکز یادگیری سایت تبیان - تهیه: فاضل صحرانشین سامانی

تنظیم: مریم فروزان کیا

تلفن : 81200000
پست الکترونیک : public@tebyan.com
آدرس : بلوارکشاورز ، خیابان نادری ، نبش حجت دوست ، پلاک 12

ارتباط با ما

روابط عمومی

درباره ما

نقشه سایت

تعدادبازدیدکنندگان
افراد آنلاین