اثر انگشت DNA ( قسمت دوم)

قسمت اول

تکنیک های مورد استفاده در اثر انگشت DNA

** استخراج DNA - DNA باید از سلول ها یا بافت بدن استخراج شود. تنها مقدار کوچکی از بافت - مانند خون، مو، یا پوست- نیاز است. برای مثال، مقدار DNA موجود در ریشه مو معمولاً مناسب است.

** تکثیر DNA- DNA استخراج شده با استفاده از تکنیک PCR تکثیر می شود.

** برش، اندازه گیری و دسته بندی: آنزیم های ویژه ی به نام آنزیم های محدود کننده برای بریدن DNA در جایگاه های ویژه ای استفاده می شود. برای مثال، آنزیمی به نام EcoR1، که در باکتری ایکولای یافت می شود، تنها DNA را در محل توالی GAATTC برش می زند. قطعات DNA براساس اندازه توسط تکنیک غرباگری به نام الکتروفورز دسته بندی می شوند. قطعات DNA از یک ژل ساخته شده از آگارز (یک ماده ژله مانند حاصل از جلبک قهوه ای) توسط جریان الکتریکی عبور می کنند. این تکنیک معادل بیوتکنولوژیک الک کردن شن و ماسه از طریق توری های ظریف برای تعیین اندازه ذرات است.

** انتقال دسته قطعات DNA به نایلون: قطعات DNA توزیع شده در سطح ژل به صفحات نایلونی یا نیتروسلولزی منتقل می شود. به این ترتیب که با قرار دادن صفحه روی ژل و خیساندن آنها در طول شب این انتقال صورت می گیرد.

** کاوش:  با افزودن کاوشگرهای هیبرید شونده رادیواکتیو یا رنگی به صفحه نایلونی، الگویی ایجاد می شود که به آن اثر انگشت DNA می گویند. هر کاوشگر به طور نمونه به یک یا دو جایگاه ویژه روی صفحه نایلونی می چسبد. اثر انگشت DNA نهایی با استفاده همزمان از چندین کاوشگر (5 تا 10 یا بیشتر) ساخته می شود. این اثر انگشت شبیه بارکدهایی (کدهای نوار مانند که زیر اسکنر خوانده می شود) است که روی محصولات غذایی در فروشگاه ها مشاهده می شوند. در تصویر زیر به طور شماتیک این مراحل نشان داده شده است.

هیبرید شدن، اتصال دو قطعه از دو توالی ژنتیکی به یکدیگر است. این اتصال حاصل پیوند های هیدروژنی بین باز ها است (فلش های صورتی). بین باز A و باز T دو پیوند هیدروژنی وجود دارد و بین باز C و باز G سه پیوند هیدروژنی وجود دارد: تصویر

برای استفاده از هیبرید سازی در آزمایشگاه، ابتدا باید DNA واسرشت شود، که معمولاً با استفاده از حرارت یا روش های شیمیایی این عمل صورت می گیرد. واسرشتی فرایندی است که طی آن پیوندهای هیدروژنی بین دو رشته اصلی DNA شکسته می شود، و DNA تک رشته ای حاصل می شود که باز ها برای پیوند هیدروژنی با کاوشگر در دسترس قرار می گیرند

وقتی DNA واسرشت شد، می توان از یک کاوشگر رادیواکتیو تک رشته ای (در تصویر آبی روشن) برای یافتن اینکه آیا DNA واسرشت حاوی توالی مکمل کاوشگر است یا خیر استفاده کرد. DNA واسرشت شده در داخل یک بسته پلاستیکی همراه با کاوشگر و مقدار مایع نمکی قرار داده می شود؛ سپس بسته تکان داده می شود تا مواد در تماس با یکدیگر قرار گیرند. اگر کاوشگر جایگاه مناسب پیدا کند، به DNA متصل خواهد می شود.

لازم نیست اتصال کاوشگر به DNA دقیق باشد. توالی های مختلف مشابه که تفاوت اندکی در بازها دارند، می تواند به DNA متصل شود، هرچند این اتصال ضعیف باشد. در اتصال ضعیف تر، پیوندهای هیدروژنی کمتر بین کاوشگر و DNA واسرشت وجود دارد. قدرت گاوشگر های با شباهت کمتر برای حفظ اتصال را می توان با تغییر دمای محیط واکنش هیبریداسیون، یا با تغییر مقدار نمک محیط واکنش دستکاری کرد.

منابع:

Henry, R J. (2001) Plant Genotyping: The DNA fingerprinting of Plants, CABI Publishing, New York.

Ha, W. Y., Shaw, P. C., Liu, J., Yau, F. C., and Wang, J. (2002) Authentication of Panax ginseng and Panax quinquefolius using amplified fragment length polymorphism (AFLP) and directed amplification of minisatellite region DNA (DAMD) J Agric Food Chem 50(7): 1871-1875

.