کشت باکتری در محیط کشت مایع
پژوهشگران عزیز در بسیاری از پروژه های زیست از جمله پروژه مبارزه با میکروب ها یکی از مهارت های پرکاربردی که نیاز خواهید داشت کشت باکتری و انتقال آن هاست در ذیل مطلبی در این خصوص بیان می شود:
کشت باکتری: به رشد دادن باکتری‌ها روی مواد مورد نیاز آن‌ها کشت (culture) می‌گویند. باکتری‌ها مانند هر موجود زنده‌ی دیگری برای رشد به مواد غذایی نیاز دارند. آن‌ها به واسطه‌ی اندازه‌ی کوچک‌شان و سیستم فیزیولوژی ویژه‌ای که دارند تنها قادر به دریافت مواد غذایی محلول می‌باشند.
با توجه به این نیاز باکتری‌ها محیط‌کشت‌های (culture medium) گوناگون مایع و جامد برای آن‌ها ساخته شده است. منظور از محیط‌کشت جامد، محیط‌هایی است که عموماً حاوی 98 درصد آب و 2 درصد مواد حل شدنی جامد هستند، اما به خاطر داشتن ماده‌ی آگار در دمای بالا مایع و در دمای پایین ژله‌ای می‌باشند. باکتری‌ها بر اساس نیازهای غذایی‌شان به انواع پرنیاز و کم‌نیاز دسته بندی می‌شوند.
پلیت‌های حاوی محیط‌کشت نوترین آگار(زرد) و بلاد آگار یا آگار خونی (قرمز)
در آزمایش‌های میکروبی انتقال باکتری‌ها از محیط‌کشت‌های گوناگون به یک‌دیگر امری رایج می‌باشد. روش‌های استانداردی برای این کار وجود دارد که رعایت اصول آن برای گرفتن نتایج درست و جلوگیری از آلودگی و بی‌آمدهای ناخواسته لازم است. کشت اولیه می‌تواند از انتقال نمونه‌های زیستی (مانند سطح پوست، ادرار، مواد غذایی، خاک و ...) به محیط‌کشت، از کشت قبلی یا از انتقال نمونه‌های باکتریایی تجاری که به صورت پودر یا سوسپانسیون ارائه می‌شوند، تهیه گردد.
توجه:
پیش از آغاز هر کاری در آزمایشگاه ضدعفونی کردن دست‌ها با الکل 70% ضروری است.
تمامی کشت‌های میکروبی الزاماً کنار شعله یا زیر هود کلاس دو به بالا انجام می‌شود.
انتقال باکتری از کشت مایع به مایع
محیط‌کشت‌های مایع عموماً در ظروف قابل‌استریل‌کردن با دهانه‌ی باریک مانند لوله‌ی آزمایش یا ارلن (برای حجم بیش‌تر از 10 میلی‌لیتر) آماده می‌شوند که تا جای ممکن از ورود آلودگی به آن‌ها جلوگیری شود. زیرا این محیط‌ها دارای مواد لازم برای رشد انواع میکروب‌ها بوده و آمادگی بالایی برای رشد میکروب‌ها ناخواسته دارند. در این حالت دو لوله‌ی آزمایش داریم که یکی حاوی محیط‌کشت استریل بوده و دیگری حاوی سوسپانسیون باکتری می‌باشد. سوسپانسیون باکتری در حقیقت شامل باکتری‌هایی‌ست که در محیط‌کشت مایع رشد کرده‌اند. هر دو لوله باید با پنبه یا فویل یا درپیچ، دربسته باشند و تنها هنگام کار کنار شعله یا زیر هود باز شوند.
1. هر دو لوله را درون جالوله‌ای کنار شعله بگذارید.
2. لوله‌ی حاوی باکتری رشدیافته را بردارید و با دست چپ نگه دارید.
3. سوسپانسیون باکتری را خوب به هم بزنید تا محتوای آن یک‌نواخت باشد.
4. در حالی که نمونه‌بردار را با شست، سبابه و کف دست گرفته‌اید، به کمک انگشت‌های انتهایی دست راست در لوله را کنار شعله باز کنید و سر لوله را شعله‌پاشی کنید (یکی دوبار از روی شعله عبور دهید).
5. با وسایل نمونه‌برداری مانند پیپت استریل و پوآر یا سمپلر (نمونه‌بردار قابل تنظیم برای حجم‌های کم و زیاد) از سوسپانسیون حجم موردنیاز را بردارید. نمونه‌هایی از سمپلر در شکل نشان داده شده است.
6. درِ لوله‌ی اول را بگذارید و لوله را در جالوله‌ای قرار دهید.
7. لوله‌ی دوم را به همان ترتیب بردارید و محتوای نمونه‌بردار را در آن خالی کنید.
8. لوله را به هم بزنید تا سوسپانسیون یک‌نواخت گردد و آن را در محل مناسب رشد بگذارید.
انتقال باکتری از جامد به مایع
در این حالت یک محیط‌کشت جامد حاوی کلنی‌های (colony) باکتری و یک لوله‌ی آزمایش حاوی محیط‌کشت استریل داریم.
1. کنار شعله، پلیت را در دست چپ گرفته و روی چهار انگشت خود قرار دهید.
2. در پلیت را با انگشت سبابه و شست بگیرید به طوری که بتوانید در را تا نیمه با انگشت شست یا سبابه (به نظر من کار با انگشت شست ساده‌تر است) بالا بیاورید.
3. با دست راست سوآپ استریل، لوپ سوزنی یا حلقه‌ای را بردارید. لوپ را با شعله سترون کنید.
4. مقداری از کلنی رشدیافته روی محیط جامد (به اندازه‌ی یک نقطه یا ه در این متن هم کافی است!) را بردارید.
5. در پلیت را ببندید و آن را به کنار بگذارید.
6. لوله‌ی آزمایش را طبق روش یادشده بردارید و لوپ را در آن تکان دهید. باکتری‌های موجود در یک کلنی به دلیل رشد در رطوبت کم (محیط‌کشت جامد) ماده‌ی چسب‌ناکی (موکوسی) پیرامون خود تولید می‌کنند که سبب چسبیدن آن‌ها به یک‌دیگر می‌گردد. نوع و میزان موکوس بسته به نوع باکتری متفاوت است. بنابراین برای یک‌نواخت شدن محیط‌کشت مایع در این حالت، باید محیط‌کشت مایع را به شدت به هم بزنیم. در صورت وجود شیکر می‌توان از آن برای هم‌زدن محیط استفاده کرد.
انتقال باکتری از کشت مایع به جامد
در این حالت یک پلیت حاوی محیط‌کشت جامد استریل و یک لوله‌ی آزمایش حاوی سوسپانسیون باکتری داریم.
1. بسته به حجم موردنیاز برای کشت، با نمونه‌بردار حجمی، سوآپ و یا لوپ از سوسپانسیون باکتری به روشی که پیش‌تر گفتیم، مقدار لازم باکتری را برمی‌داریم.
2. در پلیت را کنار شعله باز کرده و باکتری را به آن منتقل می‌کنیم. این مرحله با توجه به هدف ما از انتقال باکتری می‌تواند به روش‌های گوناگونی انجام شود:
- معمول‌ترین روش، کشتِ چهار-مرحله‌ای می‌باشد که برای به دست آوردن تک‌کلنی و مشاهده‌ی تغییرات ناشی از رشد باکتری در محیط‌کشت (مثل همولیز) روش مناسبی است.
در این روش مطابق شکل، از یک طرف پلیت شروع کرده و چند بار پلیت را به اندازه‌ی 60 تا 90 درجه می‌چرخانیم.
در این روش معمولاً از سوآپ استفاده نمی‌شود. چون با جذب باکتری به درون پنبه، در مقدار باکتری منتقل‌شونده ایجاد خطا می‌کند.
برای گرفتن تک کلنی پیش از هر مرحله لوپ را می‌سوزانیم و با گوشه‌ای از محیط کشت که با باکتری در تماس نیست سرد می‌کنیم و در آخرین مرحله از کشت لوپ را نمی‌سوزانیم.
- کشت چمنی یک کشت یک‌نواخت در سطح پلیت به ما می‌دهد و بیش‌تر برای آنتی‌بیوگرام و سنجش هاله‌ی عدم رشد اطراف مواد مهارکننده‌ی رشد و یا برای شمارش تمام کلنی‌های موجود در واحد حجم کشت‌داده‌شده، استفاده می‌شود.
در این روش بیش‌تر از سوآپ برای پخش یک‌نواخت باکتری استفاده می‌شود. هم‌چنی می‌توان با پیپت پاستور یک پخش‌کننده (spreader) به شکل زیر ساخت و از آن برای پخش کردن سوسپانسیون در همه‌جای محیط کشت استفاده کرد.
پخش‌کننده‌ی فلزی با قابلیت استریلیزاسیون به کمک حرارت مستقیم شعله
شکل شماتیک پخش‌کننده تهیه‌شده از پیپت شیشه‌ای پاستور
تصویری از پیپت پاستور پیش و پس از خم شدن
مراحل تهیه‌ی پخش‌کننده از پیپت پاستور
(لینک فیلم تهیه‌ی پخش‌کننده از پیپت پاستور)
روش کشت دادن روی محیط کشت جامد به کمک پخش‌کننده
- کشت خطی برای مشاهده‌ی اثر آنتاگونیستی دو یا چند میکروب بر هم انجام می‌شود.
- کشت چند بخشی هم اغلب برای نگه‌داری سویه‌های میکروبی به مدت کوتاه در یخچال انجام می‌گیرد.
در این روش پلیت از قسمت کف با مارکر به چند بخش تقسیم شده و در هر کدام یک سویه‌ی متفاوت کشت داده می‌شود.
انتقال باکتری از کشت جامد به جامد
در این حالت اگر محیط کشت دوم در پلیت تهیه شده باشد: انتقال باکتری از نظر برداشتن باکتری اولیه شبیه کشت جامد به مایع است و از نظر روش کشت روی محیط جامد تفاوت چندانی با انتقال باکتری از محیط مایع به جامد ندارد.
اما در مواردی محیط‌کشت جامد در لوله‌ی آزمایش تهیه می‌شود. کاربرد این روش در مشاهده‌ی توانایی حرکت باکتری یا هوازی/ بی‌هوازی بودن آن و به طور کلی در موارد تشخیص بیوشیمیایی باکتری می‌باشد. اگر محیط‌کشت در لوله صاف باشد از لوپ سوزنی و اگر مایل باشد از لوپ حلقوی برای کشت استفاده می‌کنیم. نحوه‌ی برداشت باکتری مجدداً با روش‌های پیشین فرقی ندارد.
کشت در محیط جامد با استفاده از لوپ سوزنی برای مشاهده‌ی حرکت باکتری (در لوله‌ی سمت راست باکتری به علت دارابودن تاژه حرکت کرده و کل محیط را کدر کرده است. اما در لوله‌ی سمت چپ باکتری توانایی حرکت نداشته و تنها در مسیر فرورفتن سوزن رشد کرده است.)
بخش پژوهش های دانش آموزی تبیان، تهیه: خانم سلما کاظمی
تنظیم: نسرین صادقی
