استفاده از میدان مغناطیسی برای کاهش یا محدود کردن رشد باکتری ها،جلسه دوم
ساخت محیط کشت رشد باکتری و استریل کردن آن
اهداف جلسه: در این جلسه می خواهیم محیط کشت جامد برای رشد باکتری ها درست کنیم و کمی هم درباره روش های استریل کردن بیاموزیم.
وسایل مورد نیاز
ترازو
پودر محیط کشت جامد
آب مقطر
ارلن، استوانه مدرج
پلیت پلاستیکی استریل
شعله، توری، سه پایه
پنبه و الکل
اتوکلاو
هزینه
زیاد
محیط کشت مورد نیاز برای رشد باکتری ها
ما سه نوع محیط کشت رشد باکتری بر اساس خواص فیزیکی آن داریم که هر کدام از آنها برای هدفی خاص مورد استفاده قرار می گیرد:
1-محیط کشت جامد: برای جداسازی میکروب ها.
2- محیط کشت نیمه جامد: برای شناسایی باکتری های متحرک
3- محیط کشت مایع: برای زیاد کردن میکروارگانیسم ها و تولید محصولی خاص.
ما در این پروژه از محیط کشت جامد برای سنجش رشد باکتری های محیطی تحت تاثیر یک میدان مغناطیسی استفاده خواهیم کرد. محیط کشت جامد محیطی است که علاوه بر داشتن مواد غذایی مورد نیاز باکتری ها برای رشد، ماده ای به نام آگار نیز در خود دارند. آگار مانند ژلاتین عمل می کند و باعث می شود محیط مان حالت ژله ای به خود بگیرد.
امروزه در بازار انواع مختلفی از محیط های جامد وجود دارد که یکی از پرکاربرد ترین آنها "نوترینت آگار" نام دارد.
روش های استریل کردن
یکی از روش های رایج سترون یا استریل کردن روش حرارتی است که خود انواع مختلفی دارد:
• گرمای خشک
برای لوازم شیشه‌ای وفلزاتی چون پنس به کار می‌رود شامل:
۱. سوزاندن: وسایل کثیف مانند باند زخم و... را با آتش می‌سوزانیم.
۲. حرارت مستقیم: توسط شعله چراغ وسایلی مانند پنس و آنس را استریل می‌کنیم.
۳. شعله پاشیدن: با شعله دادن به دهانه ارلن و لوله آزمایش سبب کم شدن آلودگی می‌شود.
۴. دستگاه فور: با تنظیم حرارت خشک ۱۸۰-۱۶۰ درجه سانتی گراد در این دستگاه، پس از ۲ ساعت وسایل استریل می‌شود. فور برای استریل کردن پلیت‌های شیشه‌ای، پیپت‌ها، لوله‌های آزمایش، لوازم دندانپزشکی، سرسوزن، سرنگ شیشه‌ای، ابزارهای جراحی تیز و ظریف کاربرد دارد و سبب خوردگی، زنگ زدگی و کند شدن لبه تیز وسایل نمی‌شود. وسایل دیگری مثل پارافین، ژل، پودر و غیره که امکان استریل شدن به وسیله گرما را ندارند به این طریق استریل می‌شوند.
• گرمای مرطوب
گرما همراه رطوبت برای استریل استفاده می‌شود و شامل:
۱. جوشاندن: یکی از قدیمیترین روشهای استریل است که اطمینان چندانی ندارد. در ظرفی مقداری آب ریخته و اشیاء را در آن قرار داده ومدت ۲۰-۱۰ میجوشانیم.
۲. تندالیزاسیون: برای استریل موادی که در دمای بالای ۱۰۰ تخریب می‌شوند به کار می‌رود. که برای سترون مواد پروتئینی، سرم ها و واکسن ها به کار می‌رود. در سه روز متوالی ماده مورد نظررا به مدت نیم ساعت در گرما قرار می‌دهیم و بعد در دمای ۳۷ درجه جهت رشد اسپور باکتری قرار می‌دهیم.
3 . استفاده از اتوکلاو
اتوکلاو چیست و چگونه استریل می کند؟
اتوکلاو یکی از دستگاه هایی است که برای استریل کردن وسایل آزمایشگاه استفاده می شود. اساس کار این دستگاه بر مبنای ایجاد بخار آب گرم در فشار بالاست. اتوکلاو وسایل ما را در دمای 121 درجه سانتی گراد و فشار 1.5 اتمسفر در مدت 15 دقیقه استریل می کند.
همان طور که در تصویر زیر دیده می شود این دستگاه به شکل استوانه است و دهانه آن به وسیله سرپوش مخصوصی که در اطراف آن گیره هایی وجود دارد محکم بسته می شود. روی این سرپوش درجه فشار هوا و سوپاپ بخار قرار دارد. درون این استوانه صفحه ای مشبک وجود دارد که زیر آن از آب پر می شود و روی آن وسایلی که باید استریل شوند قرار می گیرد.
برای به کار انداختن اتوکلاو به ترتیب زیر عمل می کنیم:
1- ابتدا اتوکلاو را تا قسمت مخصوص خود آب می کنیم. (منظور تا زیر صفحه مشبک است که در همه اتوکلاوها علامت گذاری نیز شده است)
2- وسایلی که می خواهیم استریل شوند را درون اتوکلاو قرار می دهیم. و درب آن را می بندیم. دقت شود که گیره ها محکم بسته شوند.
3- چند دقیقه ای صبر کنیم تا دمای اتوکلاو به 100 برسد در این زمان شیر بخار را باز می کنیم تا هوای اشباع به همراه کمی بخار آب از آن خارج شود. زمانی که بخار اصطلاحا به شکل دم روباه از آن خارج شد شیر را می بندیم.
4- از این زمان به بعد کم کم عقربه فشار سنج بالا رفته تا به 1.5 اتمسفر برسد و دما نیز در این حین به 121 می رسد. از این زمان به بعد زمان سنج اتوکلاو های دیجیتال به کار افتاده تا 15 دقیقه کامل شود و به صورت خودکار خاموش می شود. اگر دستگاه زمان سنج نداشت خودمان بعد از رسیدن دمای دستگاه به 121 درجه 15 دقیقه زمان می گیریم و بعد دستگاه را خاموش می کنیم.
5- دستگاه را به طور کامل خاموش می کنیم (از برق در می آوریم) شیر بخار آن را باز می کنیم و صبر می کنیم تا عقربه فشار سنج به صفر برسد.
6- حالا می توانیم گیره های در اتوکلاو را باز کنیم و وسایل خود را از آن خارج کنیم.
عکس های زیر نمونه ای از توکلاو های مورد استفاده در آزمایشگاه ها را نشان می دهد.
ساخت محیط کشت
ساخت محیط کشتبرای این کار مراحل زیر را دنبال کنید:
- قبل از شروع کار ابندا باید میز کار خود را آماده کنید:
• فضای روی میز کار را با الکل ضد عفونی کنید. اجازه دهید تا سطح با هوا خشک شود ،با دستمال کشیدن آن را خشک نکنید.
• لوازم را با رعایت ایمنی و در محل مناسب روی میز بچینید چراغ گاز یا شعله را با رعایت حداقل احتمال سوختن لباس یا مو در مکان مناسب قرار دهید.
- این مراحل را به ترتیب انجام دهید:
1- انتخاب ظرف اولیه مناسب : از ارلنی استفاده می کنیم که حداکثر 3/2 حجم آن پر شود.
2- محاسبه و توزین پودر نوترینت آگار : روی قوطی های محیط کشت عدد مخصوص ساخت آن نوشته شده است. مثلا در مورد این محیط نوشته شده است 28 گرم در یک لیتر. ما در این آزمایش نیاز به حدود 2 پلیت داریم. هر پلیت هم حدود 20 سی سی ظرفیت دارد لذا می خواهیم 40 سی سی محیط کشت درست کنیم. ( 2*20=40) با یک جدول تناسب ساده می توان محاسبه کرد که باید 10.8 گرم از پودر محیط کشت برداشت.
3- افزودن محیط و آب مقطر به ظرف : پودر محیط کشت وزن شده را به حجم مشخصی از آب مقطر یا آب بدون یون اضافه کنید.گنجایش ارلن یا بشر باید حداقل دو برابر حجم آب مورد استفاده باشد.
4- پنبه گذاری : برای اینکه حجم نمونه در طی حرارت دیدن و اتوکلاو تغییر نکند و همچنین برای حفظ شرایط استریل، مقداری پنبه سر ارلن می گذاریم.
5- یکنواخت کردن محیط: محیط کشت های مایع با همزدن یکنواخت می شوند اما محیط های جامد و نیمه جامد به دلیل داشتن آگار باید حرارت ببینند تا آگار آنها ذوب شود و محیط یکنواخت شود. دقت کنیم که محیط کشت مان در ضمن حرارت دیدن نجوشد. این کار تا زمانی ادامه پیدا می کند که محیط مان شفاف شود. مثل درست کردن ژله.
6- استریل کردن: با اتوکلاو محیط کشت را در دمای 121 درجه به مدت 15 دقیقه استریل می کنیم. (در پایین با توکلاو ونحوه کار با آن اشنا می شویم.)
7- توزین داخل پلیت: پس از کامل شدن دوره استریل سازی و خارج کردن ظرف حاوی محیط از اتوکلاو ، در شرایط استریل و کنار شعله محیط ها را داخل پلیت های استریل می ریزیم.
گاهی در آزمایش های خود نیاز به محیط کشت مایع داریم. برای ساخت این محیط از پودر محیط کشت نوترینت براث (براث=مایع) استفاده می کنیم و به روش بالا محیط را می سازیم با این تفاوت که چون این محیط در خود آگار ندارد برای همگن کردن آن نیازی به حرارت نداریم (مرحله 5). محیط مایع را به جای پلیت در لوله های آزمایش می ریزیم و آن را در انتهای کار اتوکلاو می کنیم.
منبع:
کتاب تکنیک ها در میکروبیولوژی اثر جان م. لامرت ترجمه دکتر مجتبی محسنی
مطالب مرتبط:
استفاده از میدان مغناطیسی برای کاهش یا محدود کردن رشد باکتری ها، جلسه اول
استفاده از میدان مغناطیسی برای کاهش یا محدود کردن رشد باکتری ها، جلسه دوم
استفاده از میدان مغناطیسی برای کاهش یا محدود کردن رشد باکتری ها، جلسه سوم
استفاده از میدان مغناطیسی برای کاهش یا محدود کردن رشد باکتری ها، جلسه چهارم
بخش پژوهش های دانش آموزی تبیان، تهیه: سمانه فلاح زاده
تنظیم: زینب شاه مرادی
