تبیان، دستیار زندگی
مرگ برنامه ریزی شده سلول (programmed cell death) PCD، از یک دیدگاه خودکشی سلول محسوب می شود. اما از دیدگاه زیستی این اقدام در جهت بقای گیاه انجام می پذیرد. بسیاری از پدیده هایی که در گیاه مشاهده می شوند، محصول مرگ برنامه ریزی شده سلول هستند...
عکس نویسنده
عکس نویسنده
نویسنده : اعظم اژدری
بازدید :
زمان تقریبی مطالعه :

بررسی آلودگی هوای تهران بر میزان تخریب DNA گیاهان مختلف – جلسه پنجم

بررسی آلودگی هوای تهران بر میزان تخریب dna گیاهان مختلف – جلسه پنجم

اهداف جلسه:

1- مرگ سلول در گیاهان
2- مراحل آزمایش
3- نتیجه آزمایش

1-5) مرگ سلول در گیاهان

مرگ برنامه ریزی شده سلول (programmed cell death) PCD، از یک دیدگاه خودکشی سلول محسوب می شود. اما از دیدگاه زیستی این اقدام در جهت بقای گیاه انجام می پذیرد. بسیاری از پدیده هایی که در گیاه مشاهده می شوند، محصول مرگ برنامه ریزی شده سلول هستند. تشکیل شدن آوندهای چوبی، از بین رفتن سلول های آلورون در غلات، ایجاد پاسخ فوق حساسیت یا (hypersensitive response) HR در نتیجه حمله عوامل بیماری زا، پیر شدن برگ ها و گل ها، تشکیل بافت آئرانشیم و غیره از جمله این موارد است. تا کنون ژن های بسیاری در این رابطه شناسایی شده اند. برخی از این ژن ها به عنوان نشانگر در شناسایی مرگ سلول استفاده می شوند و هم چنین نقش اندامک های سلولی مانند کلروپلاست و میتوکندری در فرآیند مرگ سلول مشخص شده است. مسیرهای متعدد سوخت و سازی و تاثیر متقابل آن ها، هم چنین تظاهر یا عدم تظاهر ژن های مختلف به پیچیدگی این فرآیند افزوده انئ. انواع اکسیژن فعال (ROS)، ترکیبات NO ترکیبات کلیدی در ایجاد مرگ سلول هستند.

مرگ سلول های موجودات زنده به دو طریق اتفاق می افتد:
الف) نکروز (Necrosis) 
ب) مرگ برنامه ریزی شده سلول (Apoptosis)
نکروز نوعی مرگ از نوع تصادفی است که در اثر آن گروهی از سلول های یک بافت از بین می روند و در مقابل در مرگ برنامه ریزی شده، سلول در اثر عوامل محرک (ویروس ها و مواد شیمیایی و غیره) و یا به صورت برنامه ریزی شده (در سلول های پیر و سلول های رویانی در حال تکامل) از بین می رود.
تفاوت های بیوشیمیایی و موفولوژیکی بسیاری بین نکروز و آپوپتوز وجود دارد. نکروز پاسخ طبیعی سلول به صدمه های فیزیولوژیکی است که با برهم خوردگی توانایی سلول برای نگه داری هموئوستازی شروع می شود، با نفوذ آب و یون های خارج سلولی تمام اندامک های درون سلولی به خصوص میتوکندری متورم می شود و سپس با از هم پاشیدگی غشای سلولی، تخریب صورت می گیرد و اجزای سیتوپلاسمی نظیر آنزیم های لیزوزومی در مایع خارج سلولی رها می شوند. بنابراین به علت پاسخ های التهابی، مرگ سلولی از طریق نکروز با تخریب گسترده بافتی همراه است. برخلاف آن در آپووتوز که اکثرا به علت تحریک های داخل سلولی اتفاق می افتد، سلول خودکشی می کند. 

بررسی آلودگی هوای تهران بر میزان تخریب dna گیاهان مختلف – جلسه پنجم



مرگ برنامه ریزی شده سلول از دوراه صورت می گیرد:
1- میتوکندری
2- گیرنده های مرگ سلولی
در هر دو راه با ساخته شدن پروتئینی به نام BAX و تاثیر این مواد بر میتوکندری ها و دیگر ارگان های درون سلول مثل لیزوزوم ها، شبکه آندوپلاسمی و دستگاه گلژی یک سری آنزیم ها به نام کاسپاز (Caspase) فعال و مرگ برنامه ریزی شده اتفاق می افتد.
سلول آپوپتوزی مشخصات موفولوژیکی خاصی دارد که مشخص ترین آن ها اجسام آپوپتوزی است. این اجسام شامل قسمتی از سیتوپلاسم و هسته در وزیکول های پلاسمایی و هم چنین حاوی ریبوزوم است. این سلول ها خیلی سریع توسط فاگوسیت ها شناسایی و حذف می شوند، بدون آن که پاسخ التهابی ایجاد کنند. حال باید بررسی کرد که آیا آلودگی های هوا می تواند موجب اختلال در روند مرگ سلولی گیاه شوند و نیز کدام گونه از گیاهان توانایی بیشتری در ادامه حیات خود در برابر آلودگی های هوا با استفاده روش مرگ برنامه ریزی شده سلولی را دارند.

2-5) مراحل عملی آزمایش

مواد مورد نیاز:
صد عدد بذر گیاه جعفری، صد عدد بذر گیاه تره، صد عدد بذر گیاه خرفه، 8 عدد نشا گیاه گل ناز، کیت (TianGen) برای استخراج DNA حاوی بافر TE – PW – LP3 – LP2 – LP1، پودر آگارز، بافرTBE، آب دیونیزه شده (DW)، ماده Master، DMSO، پرایمرF، پرایمرR، پرایمرITS

روش کار:
هر 50 بذر از گیاه جعفری، تره و خرفه و هر 4 نشا از گیاه گل ناز در یک گلدان (در مجموع 8 گلدان) با حجم 1017.8 خاک کاشته شد و 4 گلدان از هر گیاه در محیط پاک و 4 گلدان دیگر در محیط آلوده قرار داده شده و روزانه با 100 میلی لیتر آب، آبیاری شدند. شرایط نور برای تمام گیاهان یکسان بوده است. در پایان هفته سوم، گیاهان جعفری، تره و گل ناز محیط آلوده برای استخراج DNA خشک شدند و گیاه جعفری، تره و گل ناز محیط پاک تا مرحله آزمایشگاهی به صورت تر باقی ماندند. خرفه از آن جا که رشد بسیار ضعیفی در هر دو محیط داشت، مورد آزمایش قرار نگرفت.

برای استخراج DNA، از کیت TianGen محصول کشور چین به نمایندگی آریاتوس استفاده شد. بدین منظور از هر 6 گیاه ( 3 گیاه محیط آلوده و 3 گیاه محیط پاک) برگ های سبز و گلروفیل دار جدا شده و به خوبی در ظروفی ضد عفونی شده با الکل سابیده شدند و با سمپلرl μ 1000 – 100، lμ400 بافر LP1 به گیاهان سابیده شده اضافه گردید و با دستگاه ورتکس به مدت یک دقیقه ورتکس و مخلوط شدند و سپس به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق باقی ماندند و پس از 10 دقیقه، lμ130 بافر LP2 اضافه شد و 10 دقیقه با ورتکس مخلوط شدند و سپس 5 دقیقه با دور 12000RPM سانتریفوژ شدند.

بررسی آلودگی هوای تهران بر میزان تخریب dna گیاهان مختلف – جلسه پنجم



پس از سانتریفوژ مواد سلولی در دیواره ویال ها رسوب کرد و DNA که به صورت محلول در ویال ها باقی مانده بود، جدا شد و در ویال های 1.5 سی سی و تمیز دیگری ریخته شدند. سپس 1.5 برابر حجم DNA محلول (lμ500) و در واقع به میزان lμ700 بافر LP3 به ویال ها اضافه شد و به مدت 15 ثانیه مواد ورتکس شدند. بعد از ورتکس محلول به ویال های مخصوصی (CV3) منتقل شد، که این ویال مخصوص دارای فیلتری برای تفکیک DNA از سایر مواد است و به مدت 30 ثانیه با دور   RPM 12000 سانتریفوژ شدند. پس از سانتریفوژ، ماده ته مانده دور ریخته شد و lμ600 بافر PW اضافه شد و به مدت 30 ثانیه با دور RPM 12000سانتریفوژ شدند. محلول زیرین دور ریخته شد و دوباره به مدت 2 دقیقه با دور RPM12000 سانتریفوژ شد. سپس به مدت 20 دقیقه در ویال ها باز گذاشته شدند تا تمام حلال ها (الکل، بافر،...) خارج شوند و سپس ماده در ویال CV3 تمیز دیگری ریخته شدند و lμ30 بافر TE (بافر استخراج DNA) افزوده شد. بافر TE و فیلتر ویال ها دارای بار مثبت و DNA دارای بار منفی می باشد و بار مثبت رزین و فیاتر به بار منفی DNA غلبه کرده و آن را ته نشین می سازد و بدین منظور 5 دقیقه ماده در دمای اتاق قرار داده شد و سپس به مدت 2 دقیقه با دور RPM12000 سانتریفوژ شد و به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق باقی ماند. در این مرحله برای تهیه ژل 12 شانه ای یک درصد الکتروفورز، 25/0 گرم پودر آگارز با 25 سی سی بافر TBE مخلوط شد و به مدت 2 دقیقه در هیتر قرار گرفت و در ظرف پهن شانه داری ریخته شد و سپس جهت شکل گرفتن در یخچال قرار گرفت. پس از این، DNA هم به صورت کامل و هم با استفاده از دستگاه PCR و تکثیر ژن های انتخابی بر روی ژل و با استفاده از دستگاه الکتروفورز ران شد.  

3-5) نتیجه آزمایش

در طی سه هفته بررسی گیاهان در دو محیط، اختلاف رشد طولی تره در دو محیط از سایر گیاهان بیشتر و اختلاف رشد طولی جعفری، کمترین مقدار را داشته است. نکته قابل ذکر این است که گل ناز در این مقایسه با دیگر گیاهان بررسی نشده است و علت این امر آن است که گل ناز نه به صورت بذر بلکه به صورت قلمه کاشته شده است و معیار سنجش آن بقای گیاه در طی سه هفته بوده است.

مطالب مرتبط:

بررسی آلودگی هوای تهران بر میزان تخریب DNA گیاهان مختلف – جلسه اول
بررسی آلودگی هوای تهران بر میزان تخریب DNA گیاهان مختلف – جلسه دوم
بررسی آلودگی هوای تهران بر میزان تخریب DNA گیاهان مختلف – جلسه سوم
بررسی آلودگی هوای تهران بر میزان تخریب DNA گیاهان مختلف – جلسه چهارم
بررسی آلودگی هوای تهران بر میزان تخریب DNA گیاهان مختلف – جلسه پنجم

بخش پژوهش های دانش آموزی تبیان
تهیه و تنظیم: اعظم اژدری